5S rRNA是核糖體大亞基的一個組份，原核生物和真核生物都有5S rRNA，而且結構相似。
真核生物的
5S rRNA基因與其它三種rRNA基因不在同一條染色體上，它是由
核仁以外的染色體基因轉錄的，然後運輸到核仁內參與
核糖體的裝配。5S rRNA基因的數量比45S rRNA轉錄單位多，人的5S rRNA基因有500個拷貝，並且在
染色體上串連排列。
非洲爪蟾的5S rRNA基因的一個重複單位含有一個5S rRNA基因、一個不轉錄的假基因(101bp的5S rRNA基因的片段),每個重複單位間被不轉錄的間隔序列隔開，間隔序列的長度變化不定，最長達400bp；5S rRNA基因轉錄的速度很快，其結果產生過量的5S rRNA,有些最後要被降解掉。
5S rRNA基因是由
RNA聚合酶Ⅲ轉錄的，原初轉錄物的5’端與成熟的5S rRNA的5’端完全相同。在某些生物中，3’端通常含有多餘的
核苷酸，在加工時要被切除。所以,5S rRNA只需要進行簡單的加工，或者根本不需要進行加工。