單分子熒光檢測

單分子熒光檢測形式可分為基本的三種：光子爆發檢測、單分子圖像記錄和單分子光譜測繪。光子爆發檢測最為簡單，直接測定爆發的光子數。單分子成像可指示分子在圖像中的位置和發光強弱，實時跟蹤記錄單分子。

單分子熒光的典型特徵是量子跳躍現象，即會形成一個發射-暗態交替的量子躍遷過程，這一重要特徵導致了實驗中觀察到的單分子熒光光譜和熒光強度的波動現象。這種波動現象主要取決於單分子的局域環境極其猝滅途徑。因而測量這種單分子的熒光量子跳躍過程、熒光壽命和熒光量子產率可以提供很多關於單個熒光分子所在的局域環境的特性和變化情況的信息。

單分子熒光的另一重要特徵是其偏振特性。單個熒光分子具有其唯一的固有熒光和吸收躍遷偶極矩，分子只吸收那些偏振方向與其吸收躍遷偶極矩方向一致的光子，併發出具有一定偏振方向的熒光。在單分子檢測的應用中，人們正是利用這種單個分子躍遷偶極矩的方向以及分子所處的環境的差異來研究和推測生物大分子的結構和功能的。

單分子熒光檢測自從1976年Hirschfeld第一次嘗試用全內反射熒光法實現以來，就一直在分析化學、生命科學等領域受到極大重視，但期間發展較慢，隨著熒光檢測技術的發展，直到1989年Moerner等人才成功地在低溫下首次觀察到固體基質中的單個分子的熒光。此後單分子檢測由低溫條件下發展到可在室溫下進行，趨於溫和，並且陸續實現液流、微滴和溶液中的單分子熒光檢測。1995年，Nie等用共焦熒光顯微技術首次測出溶液中自由移動的單個羅丹明分子，這種實時測量使單分子熒光記錄不僅反映出特定分子在探測區的停留時間，而且包含特徵性間歇信息。自由布朗運動中的單分子檢測的實現為以後許多實際生物體系的應用提供了可能性。

單分子光譜的獲取具有特別重要的意義。Betzig等首次獲得了室溫條件下的單分子光譜，觀察到分散在PMMA中的一種酚菁分子在不同的空間位置呈現出各異的熒光光譜。Xie等採用遠場熒光技術在室溫條件下測繪了一系列單個染料分子的熒光光譜，發現其熒光光譜的形狀和強度隨時間而波動，這種波動源自單分子熒光的典型特徵——量子跳躍現象。這些固有的漲落包含著有關單分子和其周圍環境之間豐富的動態信息。單分子熒光光譜的獲取現已可在極短的時間內完成，這就意味著光譜測量時，分子無須空間上固定化，而可在自由溶液中進行。這種單分子光譜法可用於高通量篩查疾病標記物的單分子及監控單一分子的相互作用。

通過系統各個部分的完全整合，用戶可以通過一個界面控制全部的實驗。專門的應用嚮導快速和方便地提供可重複的實驗結果。高度的自動化，提供了新的記錄策略。在線SMD數據顯示和交互反饋，保證了數據質量的嚴密控制。

通過可調節激發光和優化光譜範圍檢測，可以得到最高質量的FLIM數據。利用方便的SMD FLIM嚮導，可以自動獲得FLIM激發和檢測堆。這對於分離多色樣品的熒光分離以及新染料的特徵描述是非常有用的。

在線顯示重要的統計控制參數，如相關曲線、快速FLIM圖像、計數率、分子亮度或最大分子計數數量，能在運行FCS或FLIM實驗過程中，連續評估數據質量。SMD數據可以在測量系列過程中就得到解釋。

由於通用的SMD原始數據格式，同一個數據文件可以有不同的分析方法。根據硬體和實驗設計，相關和壽命信息可以從一個單獨的測量中提取出來，得到有關樣品的最大信息。FCS系統可以升級配備FLIM，反之也可以，可以達到最大靈活的的FLCS配置。

單分子熒光檢測在化學分析、DNA測序、納米材料分析、醫學診斷、法醫分析、單DNA操縱、活細胞分析、分子動力學機理等方面都具有獨特的應用價值，對許多學科領域的發展產生了和正在產生著深遠的影響。單分子水平上的生物分子研究，揭示了生物大分子的結構和功能，單分子熒光檢測尤其在生命科學中具有廣闊的應用前景，為生命科學提供了新的研究手段。