考馬斯亮藍法

考馬斯亮藍G-250（Coomassie brilliant blue G-250）測定蛋白質含量屬於染料結合法的一種。在遊離狀態下呈紅色，最大光吸收在488nm；當它與蛋白質結合后變為青色，蛋白質-色素結合物在595nm波長下有最大光吸收。其光吸收值與蛋白質含量成正比，因此可用於蛋白質的定量測定。蛋白質與考馬斯亮藍G-250結合在2min左右的時間內達到平衡，完成反應十分迅速；其結合物在室溫下1h內保持穩定。該法是1976年Bradford建立，試劑配製簡單，操作簡便快捷，反應非常靈敏，靈敏度比Lowry法還高4倍，可測定微克級蛋白質含量，測定蛋白質濃度範圍為0～1 000μg/mL，最小可測2.5μg/mL蛋白質，是一種常用的微量蛋白質快速測定方法。

考馬斯亮藍有G250和R250兩種。其中考馬斯亮藍G250由於與蛋白質的結合反應十分迅速，常用來作為蛋白質含量的測定。考馬斯亮藍R250與蛋白質反應雖然比較緩慢，但是可以被洗脫下去，所以可以用來對電泳條帶染色。

考馬斯亮藍法測定蛋白質含量流程：

該方法用於大多數蛋白質的定量是比較精確的，但不適用於小分子鹼性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污劑的濃度超過0．2%影響測定結果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。

1．Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然後，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

2．標準曲線蛋白質樣本的準備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標準品，例如測定抗體，可用純化的抗體作為標準。如果待測樣本是未知的，也可用抗體作為標準蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪製標準曲線。

3．將待測樣本溶於緩衝溶液中，該緩衝溶液應與製作標準曲線的緩衝溶液相同(最好用PBS)。

4．按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，如出現沉澱，過濾除去。

5．每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合后，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min．

6．根據標準曲線計算待測樣本的濃度。

注意：

考馬斯亮藍和皮膚中蛋白質通過范德華力結合，反應快速，並且穩定，無法用普通試劑洗掉。待一兩周左右，皮屑細胞自然衰老脫落即可無礙。

考馬斯亮藍顯色法的基本原理是根據蛋白質可與考馬斯亮藍G-250 定量結合。當考馬斯亮藍 G-250 與蛋白質結合后，其對可見光的最大吸收峰從 465nm 變為 595nm。在考馬斯亮藍 G-250 過量且濃度恆定的情況下，當溶液中的蛋白質濃度不同時，就會有不同量的考馬斯亮藍 G-250 從吸收峰為 465nm 的形式轉變成吸收峰為 595nm 的形式，而且這種轉變有一定的數量關係。一般情況，當溶液中的蛋白質濃度增加時，顯色液在 595nm 處的吸光度基本能保持線性增加，因此可以用考馬斯亮藍 G-250 顯色法來測定溶液中蛋白質的含量。長期以來，人們一直習慣用 Lowry 法來測定蛋白質濃度，但近些年來，越來越多的人開始用考馬斯亮藍 G-250顯色法來測定蛋白質濃度，與 Lowry 法相比，該方法具有下列優點：①方法簡單，只需一種顯色液。②反應迅速，只需一步反應，顯色可在 5 min 之內完成。③干擾少，許多被認為對 Lorwy 法有干擾的物質（如糖、緩衝液、還原劑和絡合劑）不影響該方法。儘管該方法有如此多的優點，但在實際應用中也有其缺點，如線性關係不很好，因此使用該方法測定蛋白質濃度時應特別注意。