腺苷酸環化酶

多肽、蛋白質類及兒茶酚胺激素如腎上腺素、胰高血糖素、胰島素、促腎上腺皮質素、促甲狀腺素等都是通過這一信息傳遞而發揮作用的。腺苷酸環化酶廣泛分佈於哺乳動物的細胞膜中，此酶催化ATP生成cAMP並釋放焦磷酸。

激素和相應的膜受體結合后，經G蛋白的中介激活腺苷酸環化酶。激素受體嵌在細胞膜的脂雙層內，它與激素結合的部位面向細胞外側。腺苷酸環化酶也居質膜中，位於細胞內側。

G蛋白位於細胞質膜胞漿面的一種外周蛋白，由3個亞基Gα、Gβ及Gγ，由於α亞基結構和作用不同，可分為 激動型G蛋白和 抑制型G蛋白兩類。

激動型 G蛋白（Gs）未被激活前，Gα蛋白與GDP結合，呈無活性狀態，一旦受體與激素結合后，即可誘發G蛋白上的Gα-GDP 與GTP交換，成為活性狀態的Gα-GTP 。同時，Gα-GTP即與Gβγ部分分離，並移動到鄰近的βγ腺苷酸環化酶部位，以激活腺苷酸環化酶，後者催化ATP變成cAMP。但Gα-GTP的壽命是短暫的，因為Gα本身具有GTP酶的活性，可以水解GTP為GDP與Pi。又成無活性的Gα-GDP，並返回與Gβγ結合成完整的無活性的G蛋白（a-βγ）-GDP。

另有一類G蛋白抑制型G蛋白（Gi），會抑制I,V,和VI亞型的AC的活性例如胰島素、生長素抑制素通過Gi使細胞內cAMP濃度下降。但Gi對II和IV型則有正向刺激作用。

另外，Ca離子跟鈣調蛋白（calmodulin）也可以激活ACI型與III和VIII型。

腺苷酸環化酶的電鏡酶細胞化學試驗方法

腺苷酸環化酶主要分佈於細胞質膜、核膜和內質網膜上。它也是一種磷酸酶，能催化ATP形成3'，5'－環磷酸腺苷（cAMP）並釋放出焦磷酸。

Howell等人（1972）首先用亞胺二磷酸腺苷（AMP－PNP）作底物，成功地對動物細胞中的腺苷酸環化酶進行了定位。現已確認，在未固定和固定的組織中，ATP－PNP是腺苷酸環化酶的專一性底物，在腺苷酸環化酶的作用下，能生成cAMP和PNP，後者與捕捉鉛離子反應，生成一種不溶性的電子密度很高的產物。但鉛能在一定程度上抑制酶活性，為克服這一缺點， Fujiomto等（1981）設計了使用二鉀亞碸（DMSO）的硝酸鉛法。下面介紹的是Fujimoto等人使用的DMSO的硝酸鉛法。

固定：配製固定液的緩衝液使用0.1M pH為7.4的二甲胂酸鈉緩衝液，內含8%蔗糖、5%的DMSO。

固定液配方： 2%多聚甲醛和0.25%戊二醛混合液。對於肝臟來說，1%以上的戊二醛固定時，可導致明顯的酶失活。但若加5%的DMSO，酶活性能較好保存。總體來說，多聚甲醛與戊二醛的濃度應因組織而異。一般在0～4℃固定2小時或室溫固定1小時。

洗滌：用配製固定液相同的緩衝液漂洗1小時～過夜，期間更換緩衝液數次；而後進行厚切片；

孵育：配方及條件見\ref{table:Enzyme-7}.

作為腺苷酸環化酶特異底物的AMP－PNP在室溫中或長期冷凍保存時，ATP、AMP－PN 和AMP－PNP－P等化合物容易增多，應引起注意。左旋咪唑的加入是由於底物AMP－PNP 容易受到組織的鹼性磷酸酶分解，加入左旋咪唑能抑制該酶的活性，在鹼性磷酸酶活性高的組織內，左旋咪唑的濃度等因素需特別注意考慮。氟化鈉為腺苷酸環化酶的激活劑，應根據組織不同進行前處理后，將氟化鈉加入到孵育液中。

后固定：后固定前，必須用不含DMSO的二甲胂酸鈉緩衝液進行充分洗滌。

殘存的DMSO可以與鋨酸反應，產生擴散性的微細顆粒。后固定用二甲胂酸鈉緩衝液配製的1%～2%的鋨酸。鋨酸后固定時對酶反應產物有一定的影響，有人認為固定時間不應超過10min，超過後可引起酶反應產物顆粒變粗變大、擴散，有時由於全部溶出而導致完全沒有反應產物的陰性結果。因此認為用鋨酸固定時間最好控制在5分鐘內。也有用2～4%的戊二醛代替鋨酸進行后固定。

對照實驗中可除去底物AMP－PNP，也可在對照實驗的孵育液中加入5mM的四氧嘧啶。

DMSO的硝酸鉛法孵育液配方及條件table:Enzyme-7

孵育液配方：& Tris－順丁烯二酸緩衝液（pH 7.4） 80mM

蔗糖 8%

氟化 20mM

茶鹼 2.0mM

AMP－PNP 0.5mM

硫酸鎂 4.0mM

左旋咪唑 2.5mM

DMSO 5%（V/V）

硝酸鉛 2.0mM

孵育條件：孵育液pH 7.4

孵育溫度 37℃