磷酸酶

磷酸酶可以被分為兩類：鹼性磷酸酶和酸性磷酸酶。

酸性磷酸酶的基本性質與功能

誘導並分泌酸性磷酸酶是植物應對低磷環境的重要適應性反應之一。酸性磷酸酶可以從不同的有機磷底物上水解磷酸基團，供植物吸收利用。大多數的植物酸性磷酸酶沒有明顯的底物特異性，可以水解的底物包括 RNA、DNA、3-磷酸甘油酸、磷酸己糖等。體外實驗中，從擬南芥、番茄中純化的酸性磷酸酶的酶活力都受到了緩衝液中高 Pi 濃度的抑制，進一步研究發現酸性磷酸酶水解產生的 Pi 可以負反饋抑制大多數酸性磷酸酶的活性。酸性磷酸酶也可以分解一些特殊的有機磷底物，產物可以顯現特異的顏色，如 5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽（5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl Phosphate，BCIP，藍色）、萘酯磷酸鹽（β-NaphthylAcid Phosphate，β-NAP/Fast black K，紫紅色）、對硝基酚磷酸二鈉（p-NitrophenolPhosphate，pNPP，黃色）。通過反應產物顏色的深淺，可以判斷酸性磷酸酶的活性高低。運用這一方法可以篩選對低磷脅迫反應異常的突變體。低磷誘導的酸性磷酸酶可以分為兩類：作用於細胞內的酸性磷酸酶和分泌到細胞外的酸性磷酸酶。二者的共同作用保證了植物更好地應對低磷脅迫。細胞內的酸性磷酸酶可以通過兩個途徑實現體內磷的再循環：一是將植物液泡內的有機磷轉化為 Pi。正常情況下，植物中大部分的磷儲存在液泡中，細胞質中的 Pi 含量維持在一定範圍內。當植物受到低磷脅迫時，植物體內的 Pi 含量不斷下降，液泡中正常情況下被高磷環境抑制的酸性磷酸酶的酶活力恢復，水解液泡中儲存的有機磷並通過液泡膜上的磷轉運蛋白向細胞質分泌，維持細胞質中 Pi 含量的動態平衡。另一個實現體內磷循環的途徑是將衰老的組織中的磷活化再利用轉運到幼嫩組織。Robinson 等人報道了，擬南芥紫色酸性磷酸酶 AtPAP26 就參與了衰老組織中磷的再利用過程。分泌型的酸性磷酸酶的主要作用是分解土壤環境中的有機磷底物釋放出可以供植物直接吸收利用的 Pi。通常情況下，分泌型的酸性磷酸酶比細胞內的酸性磷酸酶更加穩定。分泌型的酸性磷酸酶的 pH 活性範圍（活性高於 50%）是 4.0-7.6，溫度活性範圍（活性高於 80%）是 22℃-48℃。這保證了它們能夠更高效、更持續地在複雜的土壤介質中發揮作用。有報道稱，土壤中植物可以直接吸收利用的 Pi，80%來源於分泌到胞外的酸性磷酸酶對土壤中有機磷底物的分解，足以見得酸性磷酸酶的重要性。

分泌型的酸性磷酸酶按照其最終發揮作用的位置又可分為釋放到環境介質中的酸性磷酸酶和附著在根表面的酸性磷酸酶。分泌到介質中的酸性磷酸酶相對而言更易於研究，是因為可以通過懸浮細胞培養或者幼苗培養的方法，收集液體培養基中的分泌蛋白。通過生化的方法富集、分離、鑒定出不同的酸性磷酸酶，並進行相關的遺傳和生理分析。近些年通過類似的研究方法，科學家們已經從多種不同的物種中鑒定得到了許多酸性磷酸酶，這些物種包括白羽扇豆、菜豆、煙草、以及擬南芥。但附著在根表面的酸性磷酸酶相對而言比較難於研究，因為很難得到大量的蛋白進行生化分析，只有遺傳學的方法是最為有效的研究手段。附著在根表面的酸性磷酸酶可以被一種人工合成的有機磷底物BCIP特異性地檢測出來。在擬南芥根表面，覆蓋一層含有0.01% BCIP、0.5%瓊脂的溶液，室溫放置過夜后，可以看到擬南芥根的表面被染成藍色，藍色的深淺程度反映出擬南芥根表面酸性磷酸酶活性的高低。根表面BCIP染色的方法被廣泛應用於與低磷響應相關的突變體的篩選中，比如：pup1、pup2和pup3突變體先後在1998年和2004年被報道，遺憾的是它們各自的突變基因沒有被鑒定出來。

酸性磷酸酶活性與有機磷的有效性

磷飢餓條件下, 植物被誘導分泌酸性磷酸酶；另一方面, 植物根系分泌酸性磷酸酶活性的增加又能夠水解釋放土壤中的有機磷化合物供植物生長。在植物體內, 酸性磷酸酶主要累積在液泡中, 大量研究表明, 酸性磷酸酶在調控植物磷營養方面有著非常重要的作用, 它在有機磷的代謝及再利用過程中也起著十分重要的作用, 其活性直接影響著有機磷有效性的高低。

在植物體內, 酸性磷酸酶對有機磷的再利用主要通過2 個功能來實現:1)將植物體內的有機磷轉化為無機磷;2)將植株中的磷從衰老組織轉運到幼嫩組織。梁宏玲的研究表明, 低磷脅迫下, 磷高效品種97081 體內酸性磷酸酶活性高於磷低效品種97009 , 低磷條件下97081 各部位酸性磷酸酶活性比97009 相應部位增加的幅度大, 植物體內磷素的分組結果也是97081 的相應部位的可溶性磷佔總磷的比例高於97009 , 說明97081 在低磷條件下, 酸性磷酸酶受到強烈的誘導, 其活性大幅度增加。97081體內磷的代謝較97009 快, 可溶性磷佔總磷的比例高, 更有利於加快磷的運輸, 促進磷的再利用。類似的研究結果在以前的研究中已有報道。為植物提供不同形態的有機磷源, 植物的生長存在差異, 說明不同的有機磷對植物的有效性是有差異的。Yadav 等利用植酸鈣鎂、卵磷脂、甘油磷酸3 種形態的有機磷和可溶性無機磷作磷源研究9 種穀類作物和油料作物時發現, 同一時間各處理作物分泌酸性磷酸酶的活性順序為：缺磷對照>植酸鈣鎂>卵磷脂>甘油磷酸>無機磷。酸性磷酸酶活性隨有機磷水解難度的增加而增加。在以有機磷作磷源進行不同作物根系分泌A PA 研究時, 還出現了不同的結果。例如Adams 等以植酸態有機磷和RNA 作磷源對2 種白羽扇豆根系分泌酸性磷酸酶活性的研究發現, 按酸性磷酸酶活性大小排列各處理, Lupinus angust i folius L .順序為:RNA >植酸態>不施磷>無機磷；而Lupinus albus L .順序為：不施磷>RNA >植酸態>無機磷, 引起這種差異的原因還不清楚。因此, 在缺磷條件下, 根系分泌到土壤中的酸性磷酸酶主要水解何種形態有機磷, 土壤種哪種形態有機磷對植物有效性更高等問題都需要進一步研究。

酸性磷酸酶分泌的基因控制

分泌酸性磷酸酶是植物普遍存在的一種對低磷脅迫的適應性反應, 而這種適應性變化也是磷缺乏響應基因協調錶達的結果, 通過響應基因產物的直接或間接作用, 促進磷素的吸收、轉運和有效利用，有關酸性磷酸酶基因的研究已經取得了很大的進展。Goldstein 等研究發現, 番茄根系在低磷脅迫下可誘導分泌性酸性磷酸酶的產生, 並具有基因表達調節和系列信號傳遞系統。在白羽扇豆上也同樣發現存在類似基因, 低磷脅迫能誘導其增強表達, 表明植物體內可能存在著低磷脅迫誘導的控制酸性磷酸酶分泌的基因。一些控制酸性磷酸酶分泌的基因已經在植物體內被定位和分離。LAS AP1 是從白羽扇豆分離到的編碼分泌酸性磷酸酶的基因, 其全長為2187 bp , 包含有一個1 914bp 長的編碼框, 編碼由637個氨基酸殘基組成的多肽, 氨基酸序列與外泌酸性磷酸酶的序列一致。

發現

鹼性磷酸酶(alkaline phosphatase , EC 3 .1 .3 .1 ,AP)是非特異性磷酸單酯酶, 可以催化幾乎所有的磷酸單酯的水解反應, 生成無機磷酸和相應的醇、酚、糖等, 還可以催化磷酸基團的轉移反應, 且大腸桿菌A P 還是一種依賴亞磷酸鹽的氫化酶。AP 存在於除高等植物外幾乎所有的生物體內, 可直接參加磷代謝, 在鈣、磷的消化、吸收、分泌及骨化過程中發揮了重要的作用。1911 年Levene 等、1912 年Grosser 等分離到(鹼性)磷酸酯酶;1934 年, Davis 提出了鹼性磷酸酶這一命名;1958 年,Ag ren 等用同位素標記的方法分離到磷酸絲氨酸;1961 年, Schwartz 在大腸桿菌中也發現了這一複合物, 並認為絲氨酸可能是AP 活性部位的組成成分;1962 年, Plocke 等證實AP 是一種金屬酶;1981 年, Bradshaw 測定了大腸桿菌AP 氨基酸全序列, 並克隆了大腸桿菌AP 的基因phoA ;之後多種生物AP 的基因相繼被克隆, 近些年對AP 的結構、作用機制和功能的研究越發深入, 使AP 的應用更加廣泛。

應用

徠AP 在醫學和分子生物學等領域有廣泛的用途。在臨床醫學上, 測定血清中AP 的活力已成為診斷和監測多種疾病重要手段。AP 主要用於阻塞性黃疸、原發性肝癌、繼發性肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查, 患這些疾病時, 肝細胞過度製造AP , 經淋巴道和肝竇進入血液, 同時由於肝內膽道膽汁排泄障礙, 反流入血而引起血清AP 明顯升高。而血中腸型AP 明顯升高可見於各種腸道疾病, 也有文獻報道某些消化系統疾病、自身免疫性疾病及惡性腫瘤患者血中還可以出現免疫球蛋白複合物型AP , 此種A P 同工酶出現的機理尚未清楚。AP 同工酶作為腫瘤組織的一個標誌也逐漸為人們所認識, 如肺臟、睾丸、卵巢、胰腺、結腸和淋巴組織等惡性腫瘤病人血清中含有PLA P 。骨型AP 作為骨代謝異常的標誌物越來越受到臨床重視；血清骨型A P 活力的定量測定可作為監測骨形成變化的有效參數, 在其他的骨代謝異常疾病(如骨軟化症、佝僂病等)及早期甲狀腺機能亢進的病人、慢性腎衰病人、接受腎臟移植的病人血清中的骨型AP 活性均有不同程度的改變, 對骨型AP 活性的檢測及動態觀察將為疾病的早期診斷、治療效果的監測、病情預后等提供有效的依據。

在動物飼養和疾病診斷方面, AP 是反映成骨細胞活性、骨生成狀況和鈣、磷代謝的重要生化指標。鈣、磷供應不足對動物的影響主要表現為骨結構異常、軟骨病、食慾降低、生長遲緩、生產性能下降等。年幼動物血液AP 主要來自骨骼, 隨著動物長大成熟和骨骼成年化, 來自骨骼的AP 逐漸減少。在動物營養研究中, 血清AP 活性常作為重要的生化檢測指標協助評定日糧鈣、磷水平的適宜程度。在動物疾病診斷上, 依據骨質疏鬆等骨骼疾病發生時AP 活性的變化規律, 可應用血清AP 活性來診斷因鈣、磷及VD 失調所引起的骨質疾病。臨床骨型AP 的檢測比血鈣測定體內鈣營養水平更具敏感性, 因此, 國內外研究一致認為骨型AP 是反映骨改變全過程最正確的指標, 其特異性、靈敏度及準確性優於其它物質的檢測。另外, 在動物患肝疾患、胃腸疾患、腎臟疾病和缺鋅時, 血清AP 均會有改變, 如果繼續對臟器特異性、A P 變化機制、AP 在不同動物體內生理功能深入研究, 會使AP 在獸醫臨床上意義更大。

在免疫學研究方面, 已廣泛應用AP 標記抗體進行酶聯免疫熒光反應(E LISA)和Western 印跡分析, 即將A P 與顯色劑或去磷酸化后能發光的底物相互作用來揭示靶與檢測酶複合物的存在, 與辣根過氧化物酶相比, AP 用作標記酶的優點是穩定性高、靈敏度高, 缺點是成本高、標記困難。在生物化學和分子生物學方面, 用AP 催化除去DNA 分子的5′末端磷酸基團以防止載體自連是基因克隆中的常規手段之一。用AP 脫去5′末端磷酸基團, 再用(γ-3 2P)A TP 標記5′末端, 可用於化學測序, RNA 測序和特異性DNA 或RN A 片段的圖譜構建。應用AP 代替同位素標記核苷酸探針用於分子雜交。研究中最常用的AP 有:①細菌鹼性磷酸酶(BAP);② SAP(來源於一種北極蝦);③小牛腸鹼性磷酸酶(CIAP);④胎盤鹼性磷酸酶(PLAP)和分泌性鹼性磷酸酶(SEAP), 後者是前者的C 末端短缺版, 與PLAP 相比, SEAP 沒有PLAP 的C末端最後24 個氨基酸(這24 個氨基酸構成了與糖基化磷脂醯肌醇靶向錨定的區域)。另外, 將phoA基因與其它基因融合表達雜合蛋白可用於基因表達的研究。在1995 年還報道了以AP 作為識別元件的生物感測器。工業上一個普遍的應用是基於巴氏殺菌可破壞AP , 因此將AP 作為檢驗牛奶的巴氏滅菌的標誌。

半胱氨酸依賴的磷酸酶通過形成磷酸－半胱氨酸中間體來催化磷酸酯鍵的斷裂，具體過程如下（以磷酸化的酪氨酸去磷酸化過程為例，參見右圖）

首先，酶活性位點上的自由的半胱氨酸親核基團進攻磷酸基團中的磷原子並成鍵；然後，連接磷酸基團與酪氨酸的P-O鍵接受位置合適的酸性氨基酸（如天冬氨酸）或水分子所提供的質子，發生質子化，從而形成磷酸－半胱氨酸中間體；這一中間體被另一個水分子所水解，酶的活性位點被釋放，可以繼續下一個去磷酸化反應。

金屬磷酸酶的活性位點上結合了兩個催化所必需的金屬離子。而對於這兩個金屬離子的性質的研究結果並不一致，因此到目前為止還沒有定論。現有的證據只能夠表明，這兩種金屬可以是鎂、錳、鐵、鋅的任意組合，並且兩個金屬離子之間通過一個氫氧根離子相連。目前認為這一氫氧根離子參與了對磷的親核攻擊。

根據所催化的底物特異性，磷酸酶可以被細分為如下五種。

類別 例子 底物

酪氨酸特異性磷酸酶 PTP1B 磷酸化酪氨酸

絲氨酸/蘇氨酸特異性磷酸酶 PP2C 磷酸化絲氨酸/蘇氨酸

雙特異性磷酸酶 VHR 磷酸化酪氨酸/絲氨酸/蘇氨酸

組氨酸磷酸酶 PHP 磷酸化組氨酸

脂類磷酸酶 PTEN 磷脂醯肌醇3，4，5-三磷酸（Phosphatidyl-Inositol-3,4,5-Triphosphate）

磷酸酶與激酶或磷酸化酶的磷酸化作用正相反。磷酸化可以使一個酶被激活或失活（如，激酶信號通路 )，也可以使一個蛋白－蛋白間相互作用發生(如SH3結構域)；因此，磷酸酶是許多信號轉導通路控制磷酸化所必需的。值得一提的是，磷酸化或去磷酸化並不一定對應著酶的激活或抑制，而且一些酶有多個磷酸化位點參與激活或抑制的調控。例如，周期素依賴性激酶（CDK）有多個能夠被磷酸化的特定氨基酸殘基，而激活或抑制對應不同殘基的磷酸化。磷酸之所以對於信號傳導很重要，其原因在於它能夠對其所結合的蛋白的行動進行調控；而除去磷酸，則是一種反向作用（如果磷酸化是激活作用，則去磷酸化就是抑制作用），磷酸酶就在這裡扮演了重要的角色。