生物活性

該概念是在 1969 年美國人 L.Hench 在研究生物玻璃時發現並提出，進而在生物陶瓷領域引入了生物活性概念，開創了新的研究領域。經過 30 多年來的發展，生物活性的概念在生物材料領域已建立了牢固的基礎，如β-磷酸三鈣可吸收生物陶瓷等，在體內可被降解吸收並為新生組織代替，具有誘出特殊生物反應的作用；羥基磷灰石由於是自然骨的主要無機成分，故植入體內不僅能傳導成骨，而且能與新骨形成骨鍵合，在肌肉、韌帶或皮下種植時，能與組織密合，無炎症或刺激反應。生物活材料具有的這些特殊的生物學性質，有利於人體組織的修復，是生物材料研究和發展的一個重要方向。

磷酸鈣材料

磷酸鈣生物活性材料主要包括磷酸鈣骨水泥和磷酸鈣陶瓷纖維兩類。前者是一種廣泛用於骨修補和固定關節的新型材料，國內研究抗壓強度已達60MPa以上。後者具有一定的機械強度和生物活性，可用於無機骨水泥的補強及製備有機與無機複合型植人材料。磷酸鈣纖維或晶須具有良好的生物活性和生物相容性，對人體無毒副作用，是生物陶瓷材料和有機高分子材料的理想增強材料。

羥基磷灰石

羥基磷灰石是目前研究最多的生物活性材料之一，作為最有代表性的生物活性陶瓷-羥基磷灰石[Ca10(P04)6(OH)2，簡稱HA]。羥基磷灰石與脊椎動物骨和齒的主要無機成分相同，結構也非常相近，與動物體組織的相容性好，無毒副作用，界面活性優於各類醫用鈦合金、硅橡膠及植骨用碳素材料。可廣泛應用於生物硬組織的修復和替換材料，如口腔種植、牙槽脊增高、耳小骨替換、脊椎骨替換等多個方面。另外，在HA生物陶瓷中耳通氣引流管、頜面骨、鼻樑、假眼球以及填充用HA顆粒和抑制癌細胞用HA微晶粉方面也有廣泛的應用。羥基磷灰石受到本身脆性高、抗折強度低的限制，因此在承重材料應用方面受到了限制。目前製備多孔陶瓷和複合材料是該材料的重要發展方向，製備塗層材料也是其重要分支之一。

生物活性玻璃

生物活性玻璃是一類能對機體組織進行修復、替代與再生、具有能使組織和材料之間形成鍵合作用的材料。生物活性玻璃（bioactiveglass，BAG）在1969年由Hench發現，由SiO2，Na2O，CaO和P2O5等基本成分組成的硅酸鹽玻璃。生物活性玻璃的降解產物能夠促進生長因子的生成、促進細胞的繁衍、增強成骨細胞的基因表達和骨組織的生長。是迄今為止唯一既能夠與骨組織成鍵結合，同時又能與軟組織相連接的人工生物材料。

材料表面在 SBF 中形成磷灰石的能力能夠反應材料在體內的生物活性，具體檢測方法如下：

1.SBF 配置

由於SBF 溶液對於磷灰石過飽和，所以配備方法不恰當會導致溶液中磷灰石沉澱產生。整個配備過程需要確保溶液無色、透明，容器表面無沉澱出現，如果過程中產生沉澱，倒去溶液，洗凈儀器重新配製。準備一個 1000ml 的塑料燒杯。首先於塑料燒杯中裝好 700ml 離子交換蒸餾水、一個適當大小磁子，杯口密封以蒸發皿或塑料薄膜。攪拌並調節水溫至 36.5±1.5C。

按表1所列順序在 36.5C 恆溫下逐個溶解第一到第八個化合物，溶解過程

表1 配置1000 ml SBF 溶液時試劑添加順序、添加量

2.磷灰石形成能力測試

對於密質薄片材料，測出樣品尺寸並計算樣品表面積精確到 2mm 應用如下公式計算出 SBF 用量：

Vs=Sa/10,

Vs（ml）是 SBF 的體積量，Sa（mm）表示樣品的表面積。

對於多孔材料，SBF 的用量應大於上式計算量準備好塑料瓶或燒杯，裝入計算出的 SBF 體積量加熱到 36.5C，然後按示意圖往裡放置樣品。筆記：樣品在容器中放置有兩種情況，如圖 1(a)，1(b)。少數情況下，SBF 溶液會生成同 質磷灰石沉積於樣品表面。所以如果樣品放置是圖 A1(b)種情況，表徵實驗應該檢測樣品的 下表面。四個星期內，分別取出恆溫浸透不同時長的各組樣品，純水輕盈洗凈。然後將樣品放入乾燥 器中常溫乾燥。

圖1 SBF中樣品浸泡示意圖

1.四唑鹽（MTT）比色法：

檢測細胞存活和生長的方法除前面所介紹的方法外，還可用四唑鹽比色法試驗（MTT）。此法的原理是：活細胞線粒體中的琥珀酸脫氫酶能使外源性的MTT還原為難溶性的藍紫色結晶物，並沉積在細胞中，而細胞無此功能。二甲基亞碸（DMSO）能溶解細胞中的藍紫色結晶物，用酶聯免疫檢測，以在490nm波長處測定其光吸收值，可間接反應活細胞數量。在一定細胞數範圍內，MTT結晶物形成的量與細胞數成正比。

●0.25%胰蛋白酶消化細胞使其成為單細胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培養基配成1x10^9個/L的但細胞懸液，將細胞接種於96孔培養板中，每孔100ul。

●將培養板置CO2培養箱中，在37℃、5%CO2條件下，培養3-5天。

●培養3-5天後，每孔加入MTT溶液10ul，繼續置培養箱孵育3-6h，終止培養，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培養數小時，將細胞內與細胞周圍的MTT顆粒充分溶解。

●用酶聯免疫檢測儀測定每孔吸光度（OD），選波長490nm。以時間為橫軸，OD值為縱軸繪製細胞生長曲線。

用此法測細胞活力，為保證結果的準確性，最好在試驗前測定每種細胞的貼比率、倍增時間以及不同接種細胞數條件下的生長曲線，再確定每孔細胞接種數和培養時間，以保證培養終止時不會過滿。另外，實驗時設空白對照，比色時，以空白孔調零。

3.2.2 CCK-8 法

Cell Counting Kit-8（簡稱CCK-8）試劑可用於簡便而準確的細胞增殖和毒性分析。其基本原理為：該試劑中含有WST-8【化學名：2-(2-甲氧基-4-硝基苯基)-3-(4-硝基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑單鈉鹽】，它在電子載體1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲瓚產物（Formazan dye）。生成的甲瓚物的數量與活細胞的數量成正比。因此可利用這一特性直接進行細胞增殖和毒性分析。

● 製備細胞懸液：細胞計數

● 接種到96孔板中：根據合適的鋪板細胞數，每孔約100ul細胞懸液，同樣的樣本可做3個重複。

● 37℃培養箱中培養：細胞接種后貼壁大約需要培養2-4小時，如果不需要貼壁，這步可以省去。

●加入10ul CCK8：由於每孔加入CCK8量比較少，有可能因試劑沾在孔壁上而帶來誤差，建議在加完試劑后輕輕敲擊培養板以幫助混勻。或者直接配置含10%CCK8的培養基，以換液的形式加入。

●培養1-4小時：細胞種類不同，形成的Formazan的量也不一樣。如果顯色不夠的話，可以繼續培養，以確認最佳條件。特別是血液細胞形成的Formazan很少，需要較長的顯色時間（5-6小時）。

●測定450nm吸光度：建議採用雙波長進行測定，檢測波長450-490nm，參比波長600-650nm。