去磷酸化

防止質粒載體的自身連接，最常用於質粒進行單酶切連接時。

去磷酸化是由於DNA連接酶催化DNA連接時需要有磷酸基團的存在，載體在經酶切後會在切點端保留一個磷酸基團。

載體去磷酸化后因自身5'端無磷酸基團，因而不可以和自身3'端連接。但是，載體去磷酸化后3’還是有羥基的，可以與目的片段的5'端磷酸基團連接。載體的5'端和目的片斷的3’-OH不能成鍵，因而形成一個雙鏈各有一個切口的雙鏈環狀DNA，雙鏈的切口會在轉化入大腸桿菌后，在複製的過程中被修復。

若不進行去磷酸化處理，在連接反應中載體自身會優先進行連接，導致目的片段插入率降低。