DNA連接酶

連酶稱黏合酶，扮演既殊鍵角，黏合。論雙股單股黏合，黏合酶借形磷酸酯鍵'端尾端'端端連。雖細胞蛋質，例聚合酶股模版況，另單股斷裂端，聚合反程形磷酸雙脂鍵（ ）黏合(連酶片段縫合，恢復限制酶切核苷酸磷酸雙脂鍵)。聚合酶黏合程聚合反附功，細胞扮演黏合反黏合酶。黏合酶功黏合斷裂，細胞DNA複製與DNA修復的反應牽涉到DNA斷裂的合成，因此DNA黏合酶就是在上述的兩個機制扮演重要的角色。除了細胞內的黏合反應，隨著分子生物學的進展，幾乎大多數的分子生物實驗室都會利用DNA黏合酶來進行重組DNA的實驗，或許這也可以被規類為其另一種重要的功能。

連酶驗室，初腸桿菌細胞。封閉鏈缺酶，藉助提供量催化鏈'-另鏈'-磷酸二酯鍵。鏈必須互補鏈配合(連酶除)，且必須緊鄰鏈連酶催化磷酸二酯鍵。

大腸桿菌連酶量多肽鏈。對胰蛋白酶敏感，可被其水解。水解后形成的小片段仍具有部份活性，可以催化酶與NAD(而不是ATP)反應形成酶-AMP中間物，但不能繼續將AMP轉移到DNA上促進磷酸二酯鍵的形成。DNA連接酶在大腸桿菌細胞中約有300個分子，和DNA聚合酶Ⅰ的分子數相近，這也是比較合理的現象。因為DNA連接酶的主要功能就是在DNA聚合酶Ⅰ催化聚合，填滿雙鏈DNA上的單鏈間隙后封閉DNA雙鏈上的缺口。這在DNA複製、修復和重組中起著重要的作用，連接酶有缺陷的突變株不能進行DNA複製、修復和重組。

噬菌體T4DNA連接酶分子也是一條多肽鏈，分子量為60Ku，其活性很容易被0.2mol/L的KCl和精胺所抑制。此酶的催化過程需要ATP輔助。T4DNA連接酶可連接DNA-DNA，DNA-RNA，RNA-RNA和雙鏈DNA粘性末端或平頭末端。另外，NH4C1可以提高在大腸桿菌DNA連接酶的的催化速率，而對T4DNA連接酶則無效。無論是T4DNA連接酶，還是大腸桿菌DNA連接酶都不能催化兩條遊離的DNA鏈相連接。

DNA連接酶主要用於基因工程，將由限制性核酸內切酶“剪”出的粘性末端重新組合，故也稱“基因針 線”。

人教版高中生物選修3中提到的E·coliDNA連接酶，來源於大腸桿菌，可用於連接粘性末端；T4DNA連接酶，來源於T4噬菌體，可用於連接粘性末端和平末端，但連接效率低。

T4DNA連接酶

T4DNA連接酶是ATP依賴的DNA連接酶，催化兩條DNA雙鏈上相鄰的5′磷酸基和3′羥基之間形成磷酸二酯鍵。可接雙鏈DNA的平末端、相容黏末端及其中的單鏈切口，在分子生物學中有廣泛的應用。T4DNA連接酶是經原核表達，柱層析純化獲得的高純T4DNA接酶，SDS-PAGE顯示為一條62kD的蛋白條帶。本品附帶10xLigationBuffer含有ATP。適用於DNA片斷接、克隆等各種反應。

內容與儲存方法

名稱:T4DNALigase數量:20ml 保存條件:-20℃

名稱:10xLigationBuffer 數量:100ml 保存條件:-20℃ T4DNA接酶活性為3u/ml，單位定為Weiss單位（0.01Weiss單位活性的T4DNA接酶在16℃時20ml體系反應20分鐘，可以連接95%的1gλDNA-HindIII的酶切物）。無DNA外切酶或內切酶活性。可進行50次以上常規DNA接反應。低溫運輸，-20℃保存。有效期6個月。

10×LigationBuffer成分：

Tris-HClpH7.8600mM

MgCl215mM

DTT100mM

ATP10mM

連接條件

推薦在10~20ml反應體系中進行接反應，反應中DNA濃度最大可達1mM（1kbDNA約1mg/ml）。首先混合要接的DNA片段，加入10×LigationBuffer至終濃度為1×，再加入適量T4DNALigase混勻。最適連接溫度為16℃。粘末端連接效率較高，加入0.2~1mlT4DNALigase,可在室溫或16℃反應1~3小時完成反應；平末端連接效率較低，加入1mlT4DNALigase，通常需要在16℃或4℃過夜完成反應。

注意事項

1)10xLigationBuffer含有ATP，使用前應在室溫放置至融化或用手掌溫度輔助融化，然後置於冰上。不要加熱融化以免ATP降解。

2)T4DNALigase對熱敏感，容易失活。使用時請放置冰上，用后立即置冰箱中冷凍保存。

3)如需在接反應后滅活T4DNALigase，可於65℃孵育10min即可。

熱穩定DNA連接酶

熱穩定的DNA連接酶（thermostableDNAligase），是從嗜熱高溫放線菌（Thermoactinomycesthermophilus）菌株中分離純化的，一種能夠在高溫下催化兩條寡核苷酸探針發生連接作用的一種核酸酶。在85℃高溫下都具有連接酶的活性，而且在重複多次升溫到94℃之後也仍然保持連接酶的活性。在基因克隆實驗中具有重要作用。

限制性核酸內切酶（以下簡稱限制酶）：限制酶主要存在於微生物（細菌、黴菌等）中。一種限制酶只能識別一種特定的核苷酸序列，並且能在特定的切點上切割DNA分子。是特異性地切斷DNA鏈中磷酸二酯鍵的核酸酶（“分子手術刀”）。發現於原核生物體內，現已分離出100多種，幾乎所有的原核生物都含有這種酶。是重組DNA技術和基因診斷中重要的一類工具酶。例如，從大腸桿菌中發現的一種限制酶只能識別GAATTC序列，並在G和A之間將這段序列切開。目前已經發現了200多種限制酶，它們的切點各不相同。蘇雲金芽孢桿菌中的抗蟲基因，就能被某種限制酶切割下來。在基因工程中起作用。

DNA連接酶：主要是連接DNA片段之間的磷酸二酯鍵，起連接作用，在基因工程中起作用。基因工程中，大腸桿菌連接酶只連接黏性末端，而T4連接酶既可連接黏性末端，又可連接平末端。

DNA聚合酶：主要是連接DNA片段與單個脫氧核苷酸之間的磷酸二酯鍵，在DNA複製中起做用。

DNA聚合酶只能將單個核苷酸加到已有的核酸片段的3′末端的羥基上，形成磷酸二酯鍵；而DNA連接酶是在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵，不是在單個核苷酸與DNA片段之間形成磷酸二酯鍵。

DNA聚合酶是以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵形成一條與模板鏈互補的DNA鏈；而DNA連接酶是將DNA雙鏈上的兩個缺口同時連接起來。因此DNA連接酶不需要模板。 RNA聚合酶（又稱RNA複製酶、RNA合成酶）的催化活性：RNA聚合酶以完整的雙鏈DNA為模板，轉錄時DNA的雙鏈結構部分解開，轉錄后DNA仍然保持雙鏈的結構。真核生物RNA聚合酶：真核生物的轉錄機制要複雜得多，有三種細胞核內的RNA聚合酶：RNA聚合酶I轉錄rRNA，RNA聚合酶II轉錄mRNA，RNA聚合酶III轉錄tRNA和其它小分子RNA。在RNA複製和轉錄中起作用。

反轉錄酶：RNA指導的DNA聚合酶，具有三種酶活性，即RNA指導的DNA聚合酶，RNA酶，DNA指導的DNA聚合酶。在分子生物學技術中，作為重要的工具酶被廣泛用於建立基因文庫、獲得目的基因等工作。在基因工程中起作用。

解旋酶：是一類解開氫鍵的酶，由水解ATP來供給能量它們常常依賴於單鏈的存在，並能識別複製叉的單鏈結構。在細菌中類似的解旋酶很多，都具有ATP酶的活性。大部分的移動方向是5'→3'，但也有3'→5'移到的情況，如n'蛋白在φχ174以正鏈為模板合成複製形的過程中，就是按3'→5'移動。在DNA複製中起做用。

DNA限制酶作用於磷酸二酯鍵

DNA連接酶作用於磷酸二酯鍵

DNA聚合酶作用於磷酸二酯鍵

DNA解旋酶作用於氫鍵

目前已知有三種方法可以用來在體外連接DNA片段：

第一種方法是，用DNA連接酶連接具有互補粘性末端的DNA片段；

第二種方法是，用T4DNA連接酶直接將平末端的DNA片段連接起來，或是用末端脫氧核苷酸轉移酶給具平末端的DNA片段加上poly（dA）-poly（dT）尾巴之後，再用DNA連接酶將它們連接起來；

第三種方法是，先在DNA片段末端加上化學合成的銜接物或接頭，使之形成粘性末端之後，再用DNA連接酶將它們連接起來。這三種方法雖然互有差異，但共同的一點都是利用DNA連接酶所具有的連接和封閉單鏈DNA的功能。

粘性末端DNA片段的連接

DNA連接酶最突出的特點是，它能夠催化外源DNA和載體分子之間發生連接作用，形成重組的DNA分子。

平末端DNA片段的連接

常用的平末端DNA片段連接法，主要有同聚物加尾法、銜接物連接法及接頭連接法。

同聚物加尾法

這種方法的核心部分是，利用末端脫氧核苷酸轉移酶轉移核苷酸的特殊功能。末端脫氧核苷酸轉移酶是從動物組織中分離出來的一種異常的DNA聚合酶，它能夠將核苷酸（通過脫氧核苷三磷酸前體）加到DNA分子單鏈延伸末端的3′-OH基團上。由核酸外切酶處理過的DNA，以及dATP和末端脫氧核苷酸轉移酶組成的反應混合物中，DNA分子的3′-OH末端將會出現單純由腺嘌呤核苷酸組成的DNA單鏈延伸。這樣的延伸片段，稱之為poly（dA）尾巴（圖2-7）。反過來，如果在反應混合物中加入的是dTTP，那麼DNA分子的3′-OH末端將會形成poly（dT）尾巴。因此任何兩條DNA分子，只要分別獲得poly（dA）和poly（dT）尾巴，就會彼此連接起來。這種連接DNA分子的方法叫做同聚物尾巴連接法（homopolymertail-joining），簡稱同聚物加尾法。

銜接物連接法

所謂銜接物（linker），是指用化學方法合成的一段由10～12個核苷酸組成、具有一個或數個限制酶識別位點的平末端的雙鏈寡核苷酸短片段。銜接物的5′-末端和待克隆的DNA片段的5′-末端，用多核苷酸激酶處理使之磷酸化，然後再通過T4DNA連接酶的作用使兩者連接起來。接著用適當的限制酶消化具銜接物的DNA分子和克隆載體分子，這樣的結果使二者都產生出了彼此互補的粘性末端。於是我們便可以按照常規的粘性末端連接法，將待克隆的DNA片段同載體分子連接起來。

DNA接頭連接法

DNA接頭，是一類人工合成的一頭具某種限制酶粘性末端另一頭為平末端的特殊的雙鏈寡核苷酸短片段。當它的平末端與平末端的外源DNA片段連接之後，便會使後者成為具粘性末端的新的DNA分子，而易於連接重組。實際使用時對DNA接頭末端的化學結構進行必要的修飾與改造，可避免處在同一反應體系中的各個DNA接頭分子的粘性末端之間發生彼此間的配對連接。

也稱耐高溫DNA聚合酶。

1988年，Saiki從嗜熱水生真菌Thermus aquatics YT-1株中分離得到，該菌株於1969年從美國黃石國家森林公園火山溫泉中分離出。

特性

良好的熱穩定性；

70℃ 2h，殘留90%活性；

93℃ 2h，殘留60%活性；

94℃ 2h，殘留40%活性。

5’→3’聚合酶活性，對dATP有優先聚合活性；

5’→3’外切酶活性；

無3’→5’外切酶活性。

用途

聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction, PCR)。

Taq酶擴增的PCR產物，3’末端總是帶有1個非模板依賴型的突出鹼基，而這個鹼基幾乎總是A，因為Taq酶對dATP具有優先聚合活性，故可用T載體克隆。

缺點

無3’→5’閱讀校正功能，在PCR擴增過程可引起錯配，30次循環錯配率約0.25%。

措施：選擇高保真Taq酶，如Pfu。

原因：Pfu具有3’→5’外切酶活性。

注意：Pfu擴增產物為平末端。