ames試驗

ames試驗

Ames試驗全稱污染物致突變性檢測。Ames試驗的常規方法有斑點試驗和平板摻入試驗。

基本介紹


Ames試驗全稱污染物致突變性檢測。
污染物對人體的潛在危害,引起人們的普遍關注。世界上已發展了百餘種短期快速測試法,檢測污染物的遺傳毒性效應。B.N.Ames等經十餘年努力,於1975年建立並不斷發展完善的沙門氏菌回復突變試驗(亦稱Ames試驗)已被世界各國廣為採用。該法比較快速、簡便、敏感、經濟,且適用於測試混合物,反映多種污染物的綜合效應。眾多學者有的用Ames試驗檢測食品添加劑、化妝品等的致突變性,由此推測其致癌性;有的用Ames試驗檢測水源水和飲用水的致突變性(比如,美國派斯凈水器就通過了Ames試驗),探索較現行方法更加衛生安全的消毒措施;或檢測城市污水和工業廢水的致突變性,結合化學分析,追蹤污染源,為研究防治對策提供依據;有的檢測土壤、污泥、工業廢渣堆肥、廢物灰燼的致突變性,以防止維繫生命的土壤受致突變物污染后,通過農作物危害人類;檢測氣態污染物的致突變性,防止污染物經由大氣,通過呼吸對人體發生潛在危害;用Ames試驗研究化合物結構與致變性的關係,為合成對環境無潛在危害的新化合物提供理論依據;檢測農藥在微生物降解前後的致突變性,了解農藥在施用後代謝過程中對人類有無隱患;還有用Ames試驗篩選抗突變物,研究開發新的抗癌藥等等。

目的和原理


鼠傷寒沙門氏菌(Salmonella typhimurium)的組氨酸營養缺陷型(his-)菌株,在含微量組氨酸的培養基中,除極少數自發回復突變的細胞外,一般只能分裂幾次,形成在顯微鏡下才能見到的微菌落。受誘變劑作用后,大量細胞發生回復突變,自行合成組氨酸,發育成肉眼可見的菌落。某些化學物質需經代謝活化才有致變作用,在測試系統中加入哺乳動物微粒體酶,可彌補體外試驗缺乏代謝活化系統之不足。鑒於化學物質的致突變作用與致癌作用之間密切相關,故此法現廣泛應用於致癌物的篩選。
實驗用菌株的細胞壁還有能使實驗物易於滲透的突變。為了進一步增加試驗的敏感性,這些菌株的切除修復DNA的能力是缺陷的,並且還有提高錯誤傾向的DNA修復的質粒基因。

步驟和方法


Ames試驗的常規方法有斑點試驗和平板摻入試驗。
1.菌株鑒定 用於測試的菌株,需經基因型和生物學性狀鑒定,符合要求才能投入使用。
目前推薦使用的一套菌株是TA97、TA98、TA100和TA102。鑒定前先進行增菌培養。為鑒定結果可靠,需同時培養野生型TV菌株,作為測試菌基因型之對照。增菌培養用牛肉膏蛋白腖液體培養基,接種後於37℃,100r/min振蕩培養12h左右,細菌生長相為對數期末,含菌數應為1×109個/ml~2×109個/ml。
鑒定項目:
(1)脂多糖屏障丟失(rfa)用接種環或一端撓起的接種針以無菌操作術取各菌株的增菌培養液,在營養瓊脂平板上分別划平行線,然後用滅菌尖頭鑷夾取滅菌濾紙條,浸濕結晶紫溶液,貼放在平板上與各接種平行線垂直相交。蓋好皿蓋后倒置於37t溫箱,培養24h后觀察結果。
(2)R因子 劃線接種,貼放濾紙條及培養等均同上,唯濾紙條浸濕的藥液不同,為氨苄青霉素鈉溶液。TA102除pKM101外,還有pAQ1,載有抗四環素的基因,故另用濾紙條浸濕四環素溶液后貼放於劃線接種的平板上。
(3)紫外線損傷修復缺陷(△uvrB)在營養瓊脂平板上按上述方法劃線接種后,一半接種線用黑玻璃遮蓋,另一半暴露於紫外光下8sec,然後蓋好皿蓋並用黑紙包裹平皿,防止可見光修復作用。培養同上。
(4)自發回變 預先製備底平板;向滅菌並在水浴內保溫45℃的上層軟瓊脂中注入0.1ml菌液;混勻后傾於底平板上並鋪平。平皿倒置於37℃溫箱培養48h。
(5)回變特性——診斷性試驗 上層軟瓊脂中除菌液外,還注入已知陽性物之溶液,需活化系統者並加入S9mix,余同上。
組氨酸營養缺陷型由自發回變即可知。
2.斑點試驗 吸取測試菌增菌培養后的菌液0.1ml,注入融化並保溫45℃左右的上層軟瓊脂中,需S9活化的再加0.3ml-0.4mlS9mix,立即混勻,傾於底平板上,鋪平冷凝。用滅菌尖頭鑷夾滅菌圓濾紙片邊緣,紙片浸濕受試物溶液,或直接取固態受試物,貼放於上層培養基的表面。同時做溶劑對照和陽性對照,分別貼放於平板上相應位置。平皿倒置於37℃溫箱培養48h。在紙片外圍長出密集菌落圈,為陽性;菌落散布,密度與自發回變相似,為陰性。
3.平板摻入試驗 將一定量樣液和0.1ml測試菌液均加入上層軟瓊脂中,需代謝活化的再加0.3ml-0.4ml S9mix,混勻后迅速傾於底平板上鋪平冷凝。同時做陰性和陽性對照,每種處理做3個平行。試樣通常設4個~5個劑量。選擇劑量範圍開始應大些,有陽性或可疑陽性結果時,再在較窄的劑量範圍內確定劑量反應關係。培養同上。同一劑量各皿回變菌落均數與各陰性對照皿自發回變菌落均數之比,為致變比(MR)。MR值≥2,且有劑量-反應關係,背景正常,則判為致突變陽性。