顯微注射

顯微注射技術

顯微注射使用一根細針頭將DNA，RNA或蛋白直接轉入細胞質或細胞核。

操作方法

目前，以細胞內微注射和微灌注技術為基礎的玻璃針頭(GlassNeedle，精細的玻璃微量毛細移液管)的使用，已經在越來越多的實驗生物學研究領域中成為一項非常普遍的操作方法，比如在體外受精、轉基因中等等。描述這些技術最恰當的話應當稱其為---顯微操作，因為這些操作是通過單個的或多個的筒狀玻璃微量移液管、精確的定位裝置（顯微操作器）以及微量注射器或微量灌注器來在單個的細胞上進行的。

顯微技術的分類 顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等，例如多莉羊就是運用細胞核移植技術而成功的；而轉基因技術指的是將外源基因導入體細胞並能穩定的嵌入宿主動物的生殖細胞染色體中的一門技術，基因轉殖動物被定義為由人為的方式將外源基因引入體內而引起基因改變的動物，並可將遺傳特質傳遞到接續的每一世代中。應用概述 微注射應用的範圍非常廣泛，從輔助（體外）細胞受精技術至分子和細胞基本組分的轉運都需使用這一技術，比較典型的是將某些物質注射進細胞中以操作和/或監測某種特定的存活細胞中的基本機體生物化學狀態。這些可以注射進細胞的物質包括有：各種細胞器、激酶、組織化學標誌物（比如辣根過氧化物酶或者熒光黃）、蛋白質、代謝物質、微磁頭、離子、抗體、基因、分子生物學的mRNA和DNA等等。運用這一技術，也可以實現用於單個細胞或一組細胞的較少量（皮升至毫升）藥劑或藥物的精確輸送（微灌注），例如藥理學的藥物檢驗。轉基因動物的製作，可以利用基因微注射（gene microinjection）、胚幹細胞（embryonic stem cells,ES cells）、精子載體（sperm vector）、反轉錄病毒感染（retroviral vectorinfection）及體細胞核移置（somatic cell nucleartransfer）等方法達成，其中顯微注射為目前應用最普遍之方法之一。顯微注射 顯微注射法（microinjection）是利用管尖極細（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養的細胞中，然後藉由宿主基因組序列可能發生的重組（rearrangement）、缺失（deletion）、複製（duplication）或易位（translocation）等現象而使外源基因嵌入宿主的染色體內。這種顯微注射術的程序，需有相當精密的顯微操作設備，製造長管尖時，需用微量吸管拉長器（micropipettepuller），注射時需有固定管尖位置的微量操作器。這種技術的長處為任何DNA在原則上均可傳入任何種類的細胞內。此法已成功運用於包括小鼠、魚、大鼠、兔子及許多大型家畜，如牛、羊、豬等基因轉殖動物。顯微注射的優缺點 以顯微注射法轉外源基因沒有長度上的限制，目前已證明數百kb之DNA片段均可以成功產制出轉基因動物。其缺點是設備精密而昂貴、操作技術需要長時間的練習，以及每次只能注射有限的細胞。這些操作中所使用的微量移液管是用毛細管拉針器(pipettepuller)來製作的，先將玻璃毛細管加熱到其熔化的溫度，再將其拉製成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關，它可以用於精準的移液。這種精確度可以為各種類型和任意大小的細胞提供亞皮克升級或0.1微米(micron)範圍內的精確的、重複性良好的細胞內和細胞旁註射。通過運用直接的水壓（壓力注射）或者不通過使用水流，而通過施加一電場來使帶電離子運動（離子電滲法），都可以獲得將微量移液管中的物質擠噴出去的效果。常用生產轉基因動物的方式 目前最常用來生產轉基因動物的方式為：直接把重組過的 DNA 注入受精卵的原核(pronuleus) 中，將從胚胎提供者的輸卵管中取得的授精卵移到倒置顯微鏡上的微量注射台上，然後利用固定吸量管 (holdingpipette) 固定住，之後注射針則依序穿過 zona pellucida，ocyte membrane 及malepronuleus membrane后，將DNA注入，注入時可以見到原核膨大。以小鼠受精卵雄原核的顯微注射為例，顯微注射所使用的受精卵固定吸管（holdingpipette）及注射針（injectionneedle）製備很困難，除影響操作時間外，也是影響轉基因效率及基因注入后之胚胎存活及轉基因成功與否極其重要的因子。固定吸管之內、外徑分別為30、80μm是較為合適的，顯微注射針自針尖起20μm處的外徑為4μm時，可獲得良好的轉染效率。固定吸管的內徑如果太小，會導致吸力不足，對受精卵操控不易；如太大，則受精卵易受傷害，影響胚胎的存活率。顯微注射針尖如果太粗，則導致插入透明帶及原核的阻力增加，且DNA流量過多，受精卵易於裂解；太細則導致針內DNA流出速率過慢，且易阻塞，而使DNA無法順利流入原核內，影響注射效率。因此進行受精卵雄原核的顯微注射時，如何製備適用固定受精卵的吸管及顯微注射針是關乎轉基因效率極其重要的因素。轉基因動物 轉基因動物（transgenicanimal）在目前生物及醫學研究方面的應用極為廣泛，轉基因小鼠一直是研究外源基因構築型態、染色體嵌插、轉基因表現及調節的最佳模式，也是建立轉基因技術最好的工具，尤其是在轉基因家畜之前，先以小鼠進行預備試驗是求事半功倍不可或缺的過程。轉基因動物應用的領域可以包括研究基因的活動對致癌病毒與癌細胞的生長的影響、基因的活動與免疫細胞間的交互作用與調控的機制、研究基因對於生長的調控機制，以及生物學與遺傳學的機制，也被應用於以人類細胞作為組織及器官移植的發展方面，如基因參與體細胞、胚胎幹細胞及存在各個組織的幹細胞的體外誘導分化研究等等。轉基因動物除用於一般基礎研究外，對於製造具有治療效果的蛋白質、器官移植、疫苗、毒理實驗、動物品種改良及水產養殖等均有很大的貢獻。雖然截至目前為止，轉基因的研發已有若干良好的成果，但尚有若干問題待克服，所以轉基因技術的應用與發展將是不可限量的。為了使科研人員能夠順利進行上述的實驗並得到有意義的結果，這些實驗中所使用的設備不僅應當有特殊的功能，還應當同時有很高的、過硬的質量，能夠提供確保結果正確所需的可靠性、精確性以及可重複性。美國哈佛儀器公司(HarvardApparatus)即生產並銷售可用於成功完成微注射和/和微灌注所需的整套產品．如Harvard/醫療系統。

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