23S rRNA的相對分子質量約為1.2 MDa，長度約為2900 nt，分子一半以上核苷酸以分子內雙鏈形式存在，產生超過100個螺旋。它在70S核糖體的50S亞基中與核糖體蛋白質L1、L2、L3、L4、L9和L23結合形成初級複合物。對緊密狀態下23S rRNA的電鏡研究表明，23S rRNA的形狀與50S核糖體亞基相似。
23S rRNA是核糖體催化功能的核心，其結構域Ⅴ具有
肽醯轉移酶活性。位於核糖體P位點的23S rRNA部分有特定區域能與進入核糖體的
tRNA形成互補鹼基對。
P位點的23S rRNA部分是
大環內酯類抗生素的作用靶位，該類
抗生素通過與23S rRNA阻礙
肽鏈延伸。但一些
細菌可利用erm基因介導23S rRNA甲基化酶使23S rRNA的
甲基化，從而降低核糖體對抗生素的親合性；也有細菌能通過核糖體變構來影響抗生素作用。
