口蹄疫病毒

口蹄疫是由口蹄疫病毒感染引起的偶蹄動物共患的急性、熱性、接觸性傳染病。

早在17－19世紀，德國、法國、瑞士、義大利、奧地利已有口蹄疫的流行記載。歷史上，1951-1952年在英法爆發的口蹄疫，造成的損失竟高達1.43億英鎊；1967年英國口蹄疫大爆發導致40萬頭牛被屠宰，損失1.5億英鎊。英、法國等國家爆發口蹄疫后，嚴重影響到了豬肉的售價。而大量宰殺牲畜后，需要飼養的牲畜已所剩無幾，市場對動物飼料的需求大減，造成玉蜀黍和大豆等動物飼料的價格下跌。

國際上英美等發達國家都已全面消滅了口蹄疫，在發展中國家中，中國也走在牲畜防疫的前列。復旦大學生命科學院、上海農科院畜牧所、浙江農科院病毒所和中國農科院蘭州獸醫所，經過18年潛心攻關，已成功研製出抗口蹄疫基因工程疫苗---“抗豬O型口蹄疫基因工程疫苗”。中國科學院上海植物生理生態研究所科技人員，利用煙草病毒製成一種高安全性新型醫用疫苗，這種疫苗對口蹄疫病毒有特效。

FMDV是偶蹄類動物高度傳染性疾病-－口蹄疫的病原，由一條單鏈正鏈RNA和包裹於周圍的蛋白質組成，蛋白質決定了病毒的抗原性、免疫性和血清學反應能力；病毒外殼為對稱的20面體。

FMDV在病畜的水泡皮內和淋巴液中含毒量最高。在發熱期間血液內含毒量最多，奶、尿、口涎、淚和糞便中都含有FMDV。不過，FMDV也有較大的弱點：耐熱性差，所以夏季很少爆發，而病獸的肉只要加熱超過 100℃也可將病毒全部殺死。

排病毒量：在病畜的內唇、舌面水皰或糜爛處，在蹄趾間、蹄上皮部水皰或爛斑處以及乳房處水皰最多；其次流涎、乳汁、糞、尿及呼出的氣體中也會有病毒排出。

人一旦受到口蹄疫病毒傳染，經過2－18天的潛伏期后突然發病，表現為發燒，口腔乾熱，唇、齒齦、舌邊、頰部、咽部潮紅，出現水皰（手指尖、手掌、腳趾），同時伴有頭痛、噁心、嘔吐或腹瀉。患者在數天後痊癒，愈后良好。但有時可併發心肌炎。患者對人基本無傳染性，但可把病毒傳染給牲畜動物，再度引起畜間口蹄疫流行。

口蹄疫傳染途徑多、速度快。發病或處於潛伏期的動物是主要的傳染源。病毒可通過空氣、灰塵、病畜的水皰、唾液、乳汁、糞便、尿液、精液等分泌物和排泄物，以及被污染的飼料、褥草以及接觸過病畜的人員的衣物傳播。口蹄疫通過空氣傳播時，病毒能隨風散播到50－100公里以外的地方。牛、羊、豬等高易感動物，感染髮病率幾乎為100%。一般來說，成年動物患口蹄疫的死亡率在5%－20%之間，幼畜的死亡率50%－80%。口蹄疫病毒血清類型多，易變異。已發現的口蹄疫病毒有A、O、C、SAT1、SAT2、SAT3和ASIA1等7個血清型。各型的抗原不同，不能相互免疫。每個類型內又有多個亞型，目前共有65個亞型。

疫苗接種是特異性預防FMD的可靠和有效手段，安全有效的疫苗是成功地預防、控制乃至最終消滅FMD的先決條件。FMD弱毒疫苗和滅活疫苗等常規疫苗都具有良好的免疫原形，在預防和控制FMD的過程中發揮著重要作用，但由於病毒毒力返強、病毒滅活不徹底、活病毒逃逸加工廠等不安全因素，世界上一些地區FMD的暴發似乎與滅活疫苗中殘存的活病毒有關，促使人們尋求一種更加安全有效的FMD疫苗。近年來，隨著分子生物學技術的飛速發展，FMDV基因工程疫苗如亞單位疫苗、可飼疫苗、合成肽疫苗、蛋白質載體疫苗、基因缺失疫苗、活載體疫苗、核酸疫苗等不斷湧現。

1.基因工程亞單位疫苗

基因工程亞單位疫苗是指採用基因工程手段製備病原體亞單位成分，由於亞單位疫苗只含有病原體的一部分，不會引起病原體所導致的動物發病，在安全性方面大大提高。

FMDV基因工程亞單位疫苗主要是利用各種表達系統表達VP1蛋白，製成疫苗。Kupper等（1981）等克隆了FMDVVP1基因，將其插入到原核表達載體PL啟動子的下游，實現VP1基因的原核表達，並通過間接ELISA和放射免疫試驗證實了其表達產物具有抗原性，從而為FMDV基因工程亞單位疫苗的研製提供了理論依據。同年Kield用大腸桿菌表達的A型FMDVVP1蛋白免疫豬和牛，都可誘導中和抗體的產生，用高濃的VP1蛋白或重複接種牛，可使牛抵抗FMDV強毒的攻擊。Morgan證實：用A12-32二聚體多次接種豬，豬也可產生高水平的中和抗體，可以保護豬免受強毒的攻擊，但是該技術不適合O型FMDV。目前，已經發現FMDV結構基因和非結構基因2A、3C串聯起來表達，可以產生76S的類病毒粒子，提純該病毒粒子，用來免疫動物，其免疫效果類似於全病毒，可產生高水平的中和抗體，能抵抗強毒的攻擊，並徹底解決了FMDV常規疫苗散毒的危險，顯示其良好的年個月度年個前景。除此以外，酵母和桿狀病毒系統也用來表達VP1蛋白，解決VP1蛋白在原核表達系統中不被修飾加工等問題，以期提高其免疫原性。

2.可飼（食）疫苗

可飼（食）疫苗即利用膿桿菌或基因槍等技術，將免疫原性基因導入植株中，獲得表達免疫原性蛋白的植株。

FMD轉基因植物可飼疫苗是研究較早，並且效果較好的例子之一。早在1998年，Carrillo等用FMDV的主要保護性抗原基因VP1獲得了轉基因擬南芥，用葉浸提物免疫小鼠，可誘導產生特異性抗體，所有免疫的小鼠都能抵抗FMDV強毒半數致死量的攻擊，這是有關轉基因植物表達的病毒抗原使免疫動物全部獲得保護的首篇報道，而且一個免疫劑量僅為25-50mg葉片。1999年Wigdorovitta等又利用苜蓿作為受體材料，成功獲得了轉基因苜蓿，以15-20mg劑量免疫小鼠，免疫鼠能100%抵抗致死量強毒的攻擊。最近，Carrillo等又以馬鈴薯作為受體材料，成功獲得了表達VP1的轉基因馬鈴薯，動物實驗證實免疫鼠也能抵抗強毒的。FMDV轉基因植物可飼疫苗的研究成功，將為牛、羊等草食動物FMD的防治帶來光明的前景。

3.合成肽苗

合成肽苗即用根據免疫抗原表位的氨基酸序列合成的抗原決定基小肽製作的疫苗。一般是從蛋白質的一級結構並結合單克隆抗體的分析，推導出蛋白質免疫主要抗原表位的氨基酸順序，然後合成或基因工程表達這一段肽作為抗原。

Dimarch用合成O1K病毒VP1141-158和200-213片段氨基酸組成的40個氨基酸肽（半胱氨酸-半胱氨酸-200-213-脯氨酸-脯氨酸-絲氨酸-141-158-脯氨酸-半胱氨酸-苷氨酸），在其中間加上兩個脯氨酸和一個絲氨酸，使多肽折成立體構型，達到提高了單段肽（141-158-脯氨酸-半胱氨酸-苷氨酸）在豚鼠中的應答水平，並提出了N-末端氨基酸（半胱氨酸-半胱氨酸）在提高保護應答的重要性。Brown等用化學法合成了FMDVVP1基因編碼的140-160及200-213位肽段基因片段，並在大腸桿菌體內得到了表達，用其免疫牛、豬等都獲得了較好的免疫力。Doel分別用A、O、C血清型FMDVVP1序列的141-158和200-213肽段組成的40個aa合成肽，用牛和豚鼠進行了試驗，結果每個肽都產生了特異性高水平抗病毒中和抗體，在豚鼠中O、A型肽可抗各自病毒的攻擊並獲得完全保護，C型較差。

4.蛋白質載體疫苗

FMDV是細胞內增殖，其免疫應答依賴於T細胞，因而細胞因子免疫性在抗病毒防禦方面起著特別重要的作用。鑒於此，人們FMDVB細胞或T細胞抗原表位與發的蛋白質分子基因或與形成類病毒粒子（Viruslikeparticle）的結構基因融合，利用載體基因蛋白或類病毒粒子的抗原提呈作用，刺激T細胞，增殖機體細胞免疫反應。Bittle根據FMDVO1型VP1氨基酸序列，化合合成140-160段氨基酸肽與載體蛋白偶聯，能誘導保護豚鼠的中和抗體。Broekhuijsen在β半乳糖苷酶N-末端連接VP1基因的B細胞和T細胞抗原表位單拷貝或多拷貝分子，用表達的融合蛋白接種豚鼠，能誘導高水平的中和抗體，刺激T細胞，產生細胞免疫應答，抵抗強毒的攻擊。同年Clarke利用乙型肝炎病毒核心蛋白能自我包裝成類病毒粒子，將FMDV的B細胞和T細胞抗原表位連接到其蛋白的N-末端，並在痘病毒中表達，其表達的融合N蛋白在豚鼠和豬中都可誘導高水平的中和抗體。Chan將FMDVVP1的141-160aa和200-213aa串聯起來與豬IG的重鏈基因的末端融合，用其表達產物免疫的豬，可以抵抗50LD50的FMD的攻擊。由於蛋白質載體疫苗安全性高，免疫原性好，故具有誘人的應用潛力。

5.基因缺失疫苗

運用基因工程手段克隆FMDV全長cDNA，構建感染性克隆，在DNA水平上來RNA，通過缺失與病毒力相關的基因，減弱其毒力但不喪失其免疫原性。

FMDV與Mengo病毒同屬小RNA病毒，人們已通過DNA重組技術，將Mengo病毒polly（C）片段縮短，構成突變體，這種突變體對小鼠無害，而且在小鼠體內能產生高水平的抗體，保護小鼠免受強毒的攻擊，因而研究人員試圖借鑒Mengo病毒的經驗，FMDVpoly（C）片段縮短，雖然縮短了poly（C）片段的FMDV突變體的毒力沒有減弱，但這給人們某種啟發，對FMDV基因組特定位點的缺失，極有可能構建FMDV弱毒株。

X射線晶體分析發現，FMDV具有一定立體構象，其表面由VP1-VP3組成，在VP1的一個高度可變區域內，有一高度保守的β環狀（G-H環）氨基酸序列暴露於病毒粒子的表面，其中包含精氨酸-苷氨酸-天門冬氨酸（RGD）序列，構成病毒的細胞吸附位點。Ochoa等人研究FMDVVP1基因片段的主要抗原位點G-H環合成肽晶體結構時發現，針對VP1單抗可以產生一定程序的病毒凝集和很強的抑制病毒與細胞吸附作用。Acharya等也發現含有RGD序列的感染性的cDNA克隆，製備RGD缺失或突變的病毒粒子就成為可能。Mason通過取代病毒RGD序列內的氨基酸構建FMDV突變株，使病毒不能吸附和感染細胞。以上的研究均證實RGD序列是病毒吸附宿主細胞所必需的。Mckenna等用SGSNPGSL序列取代野生型SGSGVRGDFGSL的RGD編碼序列，構建了RGD缺失病毒。這種缺失RGD序列的病毒粒子不吸附和感染細胞。利用該缺失病毒進行小鼠和豬的動物試驗發現，野生型病毒對照組出現典型的FMD癥狀，試驗組無任何癥狀。通過免疫沉澱監測了這些動物在接種28d后的血樣，其中對照組顯示很強的結構蛋白活性，沒有測到非結構蛋白活性，證明了野生病毒在動物中能複製，而所構建的病毒不能複製。用海福特牛對這種病毒所做的油作比較，證明在產生血清中和抗體、刺激機體產生免疫應答、動物保護等方面與滅活疫苗一致，有些優於滅活疫苗。

6.活載體疫苗

利用基因操作技術將FMDV的保護性基因（VP1或P1）插入到另一種病毒基因組中的某些部位，使之高效表達重組蛋白。由於外源性木的基因VP1或P1已成為載體的一部分，並隨著載體病毒增殖而不停地表達，因而這種活載體疫苗在機體不但不能產生針對載體的抗體，而且可以產生針對FMDV的抗體，從而達到“一針防兩病”的目的。另外，針對FMDV多血清型，而且型間無交叉保護作用，因而可將不同型FMDVVP1或P1基因插入到同一病毒活載體中，從而組成多價基因工程疫苗來預防、控制FMD及其他相關疾病。目前常用的病毒載體主要有痘病毒，腺病毒、皰疹病毒等。Sanz-Parra等構建表達FMDVVP1和VP1基因的重組痘病毒，用該重組病毒接種豚鼠，產生針對FMDV的B細胞和T細胞的免疫反應，2000年，BerinsteinA等構建了表達FMDVC3Arg85毒株的P1基因重組痘病毒，用該重組痘病毒接種Balb/c小鼠，用ELISA檢測出高效價的抗FMDV抗體，同時能保護同源病毒強毒的攻擊；GregoryA等，用表達FMDV結構蛋白腺病毒型免疫豬，4周後用相同劑量加強免疫一次，產生高水平的FMDV中和抗體，5/6免疫豬得到了FMDV結構蛋白的VP1多肽，用該重組病毒接種牛誘導高水平的抗FMDV抗體。偽狂犬病病毒與牛傳染性鼻氣管炎病毒屬於皰疹病毒，基因組約150kb，含有許多病毒增殖和複製所非必需的基因，能容納的外源基因多，是一種很好的病毒載體。Ziji等成功地將豬瘟病毒膜蛋白E1基因插入PRV738株gC基因中得到表達，製成的疫苗使免疫豬獲得了較好的免疫力，並可抵抗PRV強毒和豬瘟ngdu的攻擊。除病毒活載體疫苗外，菌體也用來作為載體，目前已有人將FMDVVP1的部分抗原肽在菌體系統中嵌合表達。

7.核酸疫苗

核酸疫苗又稱基因疫苗，是將編碼病原體免疫保護性抗原蛋白基因置於真表達元件的控制下，並將其導入動物機體內，通過宿主細胞的轉錄系統合成抗原蛋白，從而誘導宿主產生對抗原蛋白的免疫應答。由於FMDV血清型多，各型間無交叉保護性，這給FMD的仿製帶來巨大的困難。90年代，隨著基因免疫概念的問世及完善，為FMDV免疫帶來契機。Benvenisti將FMDV完整的結構基因P1和非結構基因2A、3CD串聯起來，同時加入腦心肌炎病毒（EMCV）內部核糖體進入(IRES)，並通過免疫熒光和免疫斑點技術檢測到豬皮膚中，部分豬獲得抵抗FMDV強毒的攻擊。Shieh未了克服亞單位疫苗不能產生持久的免疫保護，通過基因免疫和亞單位疫苗聯合免疫來增強其免疫效果，首先用含有FMDV主要免疫原性VP1的質粒免疫鼠，接下來VP1多肽偶合物（P29-KLH）刺激，免疫的鼠產生高效價的抗體，並具有中和FMDV活性。

總之，理想的疫苗必須安全、有效、同時還應具備價廉、易於推廣等優點。雖然FMDV滅活疫苗具有良好的免疫原性，但潛在的不安全性影響其使用；另外，由於滅活疫苗製備成本高，價格昂貴，限制了該疫苗的推廣。基因疫苗經驗有安全性高，同時可以根據需要製備同一病毒多哥成分或多價病毒疫苗，大幅度節約生產成本等優點，因此，FMDV記憶內工程疫苗是未來的發展方向。

口蹄疫病毒不怕乾燥，但對酸鹼敏感，80℃至100℃溫度也可殺滅它。通常用火鹼、過氧乙酸、消特靈等藥品對被污染的器具、動物舍或場地進行消毒。隔離、封鎖、疫苗接種等方式可預防口蹄疫的發生。用碘甘油塗布患處、消毒液洗滌口腔等是常用的治療方法，但目前沒有特效藥。動物患口蹄疫會影響使役，減少產奶量，一般採用宰殺並銷毀屍體進行處理，給畜牧業造成嚴重損失。國際獸疫局將口蹄疫列為“Ａ類動物傳染病名單”中的首位。世界上許多國家把口蹄疫列為最重要的動物檢疫對象，中國把它列為“進境動物檢疫一類傳染病”。口蹄疫很少感染人類，但人類接觸或攝入污染的畜產品后，口蹄疫病毒會通過受傷的皮膚和口腔黏膜侵入人體。人口蹄疫的特徵是突然發熱，口、咽、掌等部位出現大而清亮的水皰，沒有有效的治療辦法，這些癥狀經2－3周后可自然恢復，不留疤痕。因此，對人體健康的危害不大。

生物工程技術 http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/21/10170018.shtml

新華網 http://news.xinhuanet.com/ziliao/2004-01/14/content_1275734.htm