血栓溶解

尿激酶與鏈激酶

尿激酶（uK）可從人尿中提純或由培養的人胚胎腎細胞分泌而得。它是由兩條分子量分別為20kDa、30kDa的多肽鏈，通過二硫鍵相連組成的一種絲氨酸蛋白酶。uK有s1（31kDa）和s2（32kDa）兩種分子形式，s1是s2的蛋白降解產物。

uK直接作用於pg上arg561-Val562肽鍵，肽鍵斷裂后，產生由二硫鍵相連的雙鏈活性分子pm，從而水解構成血栓的不溶性fn，起到溶栓作用。uK無抗原性，為其優點。

鏈激酶（sK）是由β溶血性鏈球菌分泌的蛋白酶。它是分子量為47kDa的單鏈蛋白，氨基末端為異亮氨酸（ile），羧基末端為賴氨酸（lys）。sK在血液中與pg以等摩爾比結合，形成sK·pg複合物。複合物中pg的活性位點通過分子轉位暴露在外，從而將pg激活為pm，最後發生纖溶反應，降解血栓。

現在可從類馬鏈球菌中分離sK基因，轉入大腸桿菌表達，以獲得有溶血栓活性的sK。現已可用基因工程技術大規模製備sK製劑。

進入血循環中的uK和sK均可立即激活纖溶系統，因此在藥物未到達血栓部位之前，就激活pg成pm，引起血中纖維蛋白原（fg）水平明顯下降。同時，由於pA的快速抑制物pAI1，2（pAinhibitor1,2）和α2抗纖溶酶（α2aP）的作用，迅速與之結合，並中和pA活性，使得藥物半衰期很短，在血漿內消除較快，因此，臨床治療劑量也很大。

茴香醯纖溶酶原-鏈激酶活化複合物（aPSAC）

aPSAC是將pg與sK用苯甲醯類化學試劑（如aPAN）以1:1等分子共價結合形成的pg-SK偶聯複合物。複合物中pg上的活性中心（即輕鏈的ser740位）被可逆地醯基化，以減緩pm的形成，以及免受α2aP的中和與防止過度激活血栓周圍以外的pg，降低出血傾向。

由於複合物中pg上與fn有特異親和性的賴氨酸結合位點（lBS）仍暴露在外，故sK-Pg複合物可富集於血栓部位。連接在fn上的aPSAC以一定速率脫醯化，從而形成pm，溶解fn，消除血栓。

同時，sK與pg的偶聯，掩蔽了sK的抗原位點，從而降低其免疫原性。而且，aPSAC的半衰期也較sK長。另外，在血栓位點的脫醯化作用加強了複合物的fn特異性，防止複合物自我消化作用。動物血栓模型證明，aPSAC比未經醯化修飾的pg·sK複合物具有更顯著的溶血栓效果。

組織型pA（t-PA）及其突變體

t-PA是分子量為70kDa的單鏈糖蛋白，來源於人體。在pm或胰蛋白酶作用下，t-PA的arg275-Ile276肽鍵斷裂，形成由二硫鍵相連的雙鏈。t-PA的羧基端為輕鏈（32kDa），屬絲氨酸蛋白酶樣結構域（p），是催化活性中心。氨基端則為重要鏈（36kDa），由f、eGF、k1、和k2四個結構域組成。

單鏈及雙鏈t-PA具有相同的激活pg特性。當出現血栓時，t-PA就能迅速激活pg為pm溶解血栓，其機理是：t-PA通過k2及f能特異性地連接至fn上，連接t-PA的fn/血栓增加了對pg的親和性，形成t-PA·pg·fn環狀三元複合物。被激活的pm迅速降角血栓fn。

另外，研究表明t-PA在血液中與pAI-1形成複合物后被中和、降解，在肝臟代謝。因此，其在體內被很快消除，半衰期僅為4～8分鐘。為此，研究者利用基因工程技術改變t-PA，來改善藥物動力學或功能性質。

目前國外已得到多種重組t-PA（rt-PA）突變體。缺失f、e和k1，僅存k2和p結構域，即只保留特異性結合位點及催化活性中心，得到的bM06.022是一個非糖基化突變體，在體內半衰期延長4～5倍。替代或缺失一個或幾個f、e結構域中的氨基酸也起到良好效果，如用ser替代e區cys84，其半衰期可由原來的6分鐘延長至20分鐘。又如，asn、glu（ala）4分別替代thr103、asn117、lys296-His-Ary-Arg得到的rt-PA-TNK在血液中被消除的時間延長8倍，對fn特異性增強。抗pAI-1能力增強200倍。

單鏈尿激酶型pA（scu-PA）及嵌合體

scu-PA又稱尿激酶原（pro-UK），它是雙鏈uK的酶原前體，是一種低uK活性的糖蛋白。在pm的激活下易發生肽鍵lys158-Ile159裂解，生成有活性的雙鏈形式。

當血漿中不存在fn時，scu-PA由於受到α2aP的競爭性抑制作用，比較穩定，不會激活pg；但是，一旦產生血栓，因scu-PA對連接於fn上的pg親和力高於遊離pg，從而誘導特異性血栓溶解。並且，fn的降解片段（e-2）能選擇性地促進scu-PA對pg的激活，這種促進作用是通過增強pg與已部分降解的fn的偶聯來實現的。

scu-PA最先從尿中得到，現在應用重組dNA技術來獲得人源scu-PA。它是一種低分子量衍生物，缺少氨基末端的143個殘基（rscu-PA32K）。與uK相比，具有相同的纖溶效果，但不破壞fg。兔頸靜脈血栓模型證實了scu-PA與系統纖溶的量效關係。

有人構建了重組嵌合pA，即利用rt-PA重鏈的不同區域與scu-PA的蛋白酶活性結構域組成各種嵌合體。動物血栓模型顯示k1、k2Pu（rt-PA的k1·k2與scu-PA的pu區結合）減緩了其在血漿內的代謝速度，相關抗原的半衰期從9分鐘延長至70分鐘，但仍保持相同的纖溶性，並且血液中α2aP和fg水平不變。

葡激酶

葡激酶（saK）是由金黃色葡萄球菌分泌的一種蛋白，具有纖溶活性，但天然saK有高度毒性及嚴重出血現象。

saK是一條由136個氨基酸組成的單鏈多肽。它由兩個大小相等的摺疊結構域組成，分子量為15kDa，沉降係數為1.71S。現已發現成熟saK及突變體saK-△10缺失前10個氨基酸有相同的纖溶活性。並且，26位甲硫氨酸（met）為saK的活性中心。最近又發現氨基端的氨基酸片段對於pg的激活極為重要。

saK本身並不起酶的作用，而是與pg以1:1的等分子比可逆結合。然後，以saK·pg複合物的形式激活其他遊離pg。不同於sK·pg複合物，saK·pg複合物中pg上的絲氨酸蛋白酶活性位點暴露在外，使得自身轉換為saK·pg→saK·pm是整個纖溶過程的限速步驟。saK·pm起到自身催化作用，可以加速反應進行。而血液中的α2aP能迅速與複合物中的pm結合，從而起到抑制血栓以外的纖溶作用。當出現血栓時，則saK·pg（pm）複合物中pg（pm）上的lBS能迅速與構成血栓的fn結合，這阻礙了α2aP與複合物的結合。大量激活血栓周圍遊離pg為pm，最終溶解血栓。體外實驗證明若50%血栓被溶解時，血液中pg水平僅下降5%。因此，saK具有極強的fn特異性，在激發纖溶過程中不影響fg水平。

此外，作為小分子蛋白，它穿透血栓的能力較強。在血液中的穩定性好，作用時間較長。目前是從噬菌體saKφc及saK42D中克隆saK基因，並用重組技術在大腸桿菌中進行表達，實現大規模生產。

saK有明顯的抗原性。最近有人用ala替代saK抗原決定簇上的2～3個荷電氨基酸，得到saK突變體（saKSTAR·m38），以降低其免疫原性。

上述藥物均通過將pg轉變為有活性的pm，來實現降解血栓/Fn功能。目前臨床主要用於aMI的治療。

第一代藥物sK和uK進入體內立即激活pg，形成的pm使血栓溶解的同時也使機體凝血因子失活和過度消耗，導致嚴重出血傾向。另外，這種治療由於過量消耗血液中pg，所以又易發生再栓塞。並且，兩者的半衰期短，需反覆給葯，需注射大劑量方能在血栓處達到有效濃度，這又加劇其副作用的產生，故臨床應用受到限制。

臨床發現uK對陳舊的血栓無效，而且適用範圍小，不適用於肝病、高血壓或出血性潰瘍患者。sK也有類似問題，僅能將新近產生的大血栓化解為小血栓，並有感冒樣癥狀及嚴重變態反應等副作用。

aPSAC雖然改善了sK的穩定性問題，可明顯降低給藥量。但是，臨床顯示aPSAC並不增加與fn/血栓的親和性，沒有明顯提高再通率和減少再栓塞率，仍會造成全身性纖溶現象，導致全身出血傾向；同時，依舊存在致敏性和抗原性問題。

80～90年代採用分子生物學技術得到的新型pA（rt-PA、scu-PA）對上述情況有所改善。但因其半衰期極短、臨床用量大、價格昂貴而使應用受到限制。bM06.022在aMI患者的治療中，發現它有明顯的血栓親和性，無出血併發症。嵌合體k-1K2Pn也僅有小規模的臨床前試驗，發現兩次推注10mgK1K2Pn能特異性地將冠狀動脈血栓溶解。

另外，體外血栓溶解實驗發現，rt-PA的溶血栓速度遠比sK快；但在高濃度rt-PA時，因其嚴重消耗pg，而導致纖溶系統pg水平顯著下降。而saK在相同速率的血栓溶解過程中，卻並不影響血液中pg、fg及α2aP水平。並且，在aMI治療中，同樣劑量的saK比rt-PA顯示更高的對fn特異親和性，對動脈血栓溶解、限制局部出血及神經損傷方面更有效。對aMI患者推注saK，90分鐘后冠狀動脈再通率達83%。

臨床試驗表明，saK在溶血栓速率和對fg的保護方面均優於rt-PA。但是，它有顯著的免疫原性，不能重複使用。臨床發現，對aMI患者注射saK兩周后，有73%的病人體內產生特異性抗saK抗體，這種抗體能中和saK活性。雖然用定點誘變方法得到的saKsTAR·m38改善了抗原性，但其纖溶活性相應受影響。另一方面，應用saK約30分鐘后才能起溶血栓作用，不利於病人急救。

血栓溶解藥的研究和開發應用明顯提高了aMI等血栓患者的治癒率，降低了其死亡率。但第一代藥物較弱的fn專一性導致了系統性纖溶及出血併發症；第二代藥物（如rt-Pa）雖加強了fn專一性，可是大量臨床試驗顯示其與第一代藥物無顯著區別，出血現象仍有發生。

總之，各種藥物儘管各有其優點，但仍存在不同的問題。主要問題包括：再次灌注的抗性、血管的再次栓塞率、出血併發症、臨床副作用、給藥量大及價格昂貴等。

針對血栓溶解應用中出現的上述問題，目前各國學者主要著手於以下幾方面研究：

（1）研究開發對fn特異親和性強的pA，主要是用基因工程技術，把對fn特異性親性強的基因片段與能高效激活pg的基因片段重組成r-PA，及構建偶聯pA的抗fn單克隆抗體或磁性化合物。也有學者正在研究將臨床效果較好的pA與人體血漿蛋白偶聯，組成類似aPSAC的複合物，達到增強對fn特異親和性及降低抗原性、致敏性的目的。

（2）通過篩選或誘發某些pA（如r-PA、scu-PA，saK）的突變體，獲得能抗pA抑制物（pAI1，2）的pA，以達到降低治療用量，提高激活纖溶能力的效果。

（3）積極開發各種生物來源（如蛇毒、水蛭、蚯吲、吸血蝙蝠等）的血栓溶解物質。

（4）在臨床上把pA與其他藥物聯用，以提高pA的抗栓、溶栓效率，如與血小板糖蛋白Ⅲb/Ⅲa受體阻抑劑、抗凝血酶製劑及抑制α2aP、pAI1，2的藥物（抗體）等合用。