嗜熱脂肪芽孢桿菌

嗜熱脂肪地芽孢桿菌營養細胞呈長桿狀、圓端，多數為單個、少數成對或鏈狀排列，細胞寬0．6～1.μm、長 2. 0 ～3.5μm，細胞壁為革蘭陽性結構，但染色可在陽性和陰性之間變化。芽孢呈橢圓或柱狀、端生或次端生，孢囊膨脹或不膨脹，無伴孢晶體形成。最佳生長溫度為56～60℃，最高生長溫度為65～75℃，最低生長溫度為30～ 45℃，需氧或兼性厭氧，利用葡萄糖產酸不產氣。現中國工業微生物菌種保藏管理中心(CICC)收藏菌株為嗜熱脂肪地芽孢桿菌編號為CICC 10267株，即ATCC 7953株，其在營養瓊脂上56℃培養24h的菌落形態呈淺黃色，表面粗糙濕潤，邊緣不整齊；該菌株在Cook等產孢培養基上56℃培養24h，取菌苔塗片經芽孢染色法染色后，1000倍光學顯微鏡下觀察到多數仍為染成紅色的繁殖體與部分已經形成染成藍色的芽孢形態；在產孢培養基上56℃培養5d，鏡下觀察到90%以上為已經形成染成藍色的芽孢，只有少數是染成紅色的繁殖體。

1917年Smith等人在實驗室分離出嗜熱脂肪地芽孢桿菌，1920年Donk將其歸類於芽孢桿菌屬(Bacillus)，並命名為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。傳統分類上對於芽孢桿菌屬的分類標準較為寬鬆，導致該屬細菌在生理、基因等方面存在很大差異。近年來隨著分類學研究的不斷深入，DNA G+ Cmol%、16S rDNA序列分析、核酸雜交等分類技術的不斷發展，芽孢桿菌屬細菌的分類也得到更改與修正。1949年，Gordon和Smith對收集到的216株細菌進行分類研究，其中160株被歸類於兩個嗜熱菌種：嗜熱脂肪芽孢桿菌和凝結芽孢桿菌(B．coagulans)，他們認為這兩個菌種各自代表了一組需氧、嗜熱、形成芽孢的細菌。

1991年Ash等對51種芽孢桿菌屬菌種的16S rDNA完整序列進行了分析，根據分析結果將它們分成5個不同的系統發育類群，並認為這5個類群明顯代表著不同的菌屬；同時提出芽孢桿菌屬菌種在遺傳方面相當混亂，需對其進行大量的分類學修正。Ash等的研究成果標誌著對芽孢桿菌屬進行重新分類的開始，此後從1992年至1999年陸續從芽孢桿菌屬中獨立出8個新屬。

2001年，Nazina等對芽孢桿菌屬的嗜熱菌組群進行了生理特性對比研究，在此基礎上，又對其進行脂肪酸分析、 DNA－DNA雜交、16S rDNA序列分析等一系列分類學研究。研究認為它們是一組系統發育相近、生理和形態相似的細菌，可以組成新的菌屬，並就此提出了一個新的菌屬名稱：地芽孢桿菌屬(Geobacillus)。Nazina等將包括嗜熱脂肪芽孢桿菌在內的6種菌從芽孢桿菌屬分離出來，與最近發現的新種一起歸類為地芽孢桿菌屬，該屬已得到國際上的公認。地芽孢桿菌屬中現已確切描述並命名的共有21個種及亞種，模式種為嗜熱脂肪地芽孢桿菌，模式菌株為 DSM 22T(=ATCC 12980 T)。

權威菌種保藏機構如ATCC和DSMZ，以及國際權威標準和藥典等，已經將Bacillus stearothermophilus更名為Geobacillus stearothermophilus，國內仍稱為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。

對於嗜熱脂肪地芽孢桿菌的鑒定，傳統分類中根據形態特徵、生理生化特性、生態特性等指標進行鑒定的方法耗時耗力，因此基於分子生物學的鑒定方法不斷發展。2005年，DanielR．Zeigler報道了利用recN基因序列相似性分析鑒定地芽孢桿菌屬菌種的研究。研究表明，對於屬、種及亞種水平的分類，recN基因序列分析的鑒定解析度接近甚至比16S rDNA序列分析更高，但突變飽和度限制了recN基因序列對更高層次分類的應用，然而recN基因序列分析對地芽孢桿菌屬菌株種的鑒定具有重要作用。2007年，Nomeda Kuisiene等報道了利用AluI限制性內切16S rDNA擴增片段來鑒定嗜熱脂肪地芽孢桿菌的方法。使用限制酶AluI將16SrDNA酶切，嗜熱脂肪地芽孢桿菌的16S rDNA酶切電泳圖將呈現出特殊條帶:162bp條帶的出現和76bp與86bp條帶的缺失。同年，Nomeda Kuisiene等又報道，以16S－23SrDNA內轉錄間隔區序列為靶基因設計特異性引物GEOBAC，以其PCR產物來鑒定地芽孢桿菌屬菌種。這些快速而準確的鑒定方法為嗜熱脂肪地芽孢桿菌及地芽孢桿菌屬其它菌種的研究與應用奠定了基礎。

生物指示劑標準菌

嗜熱脂肪地芽孢桿菌(ATCC 7953)所產芽孢無致病性、無熱原、無毒，且對壓力蒸汽的抵抗力在大多數微生物中最強，因此被歐洲藥典、美國藥典、日本藥典等作為熱力滅菌生物指示劑的標準菌株收錄。我國衛生部也將該菌株作為壓力蒸汽滅菌效果評價的標準檢測菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》(GB15981－1995)和《消毒技術規範》(2002版);同時，國家質量監督檢驗檢疫總局也將其作為濕熱滅菌用生物指示物列入《醫療保健產品滅菌生物指示物》(GB 18281.3－2000)標準中。嗜熱脂肪地芽孢桿菌(ATCC 7953)用於製備生物指示劑最重要的技術指標就是對一定滅菌因子有確定的抗力。2002年版《消毒技術規範》中明確規定嗜熱脂肪地芽孢桿菌(ATCC 7953)芽孢滅菌生物指示劑在121℃±0.5℃條件下的抗力指標：存活時間≥3.9min，殺滅時間≤19min，D值為1.3min－1.9min。然而同一菌株培養出的芽孢，其抗力也可能不同，此與培養方法和營養成分有關。Beaman等對該菌株粗糙型和光滑型芽孢100℃條件下的D值進行了測定，分別為124min和579min，因此製備生物指示劑必須嚴格確定菌株與菌落形態。此外，培養基成分不但對芽孢生成率有顯著影響，對芽孢的熱抗力也有明顯作用，如芽孢形成培養基中鈣離子濃度增加，可使芽孢的熱抗力增加。芽孢的形成溫度對芽孢的熱抗力也有一定影響，Cook等的研究表明，在50℃、55℃、60℃條件下形成的芽孢，培養溫度越高抗熱能力越強。綜上所述，生物指示劑的熱抗力受多種因素影響，故對其製備條件應予嚴格控制；同時對生物指示劑產品，必須使用符合標準的抗力檢測器對其抗力性能進行嚴格測試。

鮮乳中抗生素殘留檢驗

長期以來，抗生素在奶牛飼養業中應用廣泛，如為預防或治療疾病，常在飼料中添加含有一定比例抗生素的飼料添加劑，這對於長期飲用牛奶的消費者來說無疑是等於長期服用小劑量的抗生素，因此必須嚴格控制抗生素最高殘留限量。國標CB/T4789.27－2008中規定了兩種檢測鮮乳中抗生素殘留的方法－ 嗜熱鏈球菌抑製法和嗜熱脂肪芽孢桿菌抑製法。嗜熱脂肪芽孢桿菌抑製法中所用菌種為嗜熱脂肪芽孢桿菌卡利德變種(Bacillus stearothermophilusvar．calidol-actis)，該菌種在國際權威的保藏機構DSMZ中已更名為嗜熱脂肪地芽孢桿菌。該菌種對青霉素等抗生素非常敏感，生長速度快，此外其還有一個重要特性是最佳生長溫度範圍較高，僅有少數微生物可在該溫度範圍內生長，因此雜菌影響結果的可能性很小。

罐頭食品經過加熱處理后一般殘留的細菌為嗜熱菌及其芽孢。嗜熱脂肪芽孢桿菌是一種兼性厭氧菌，嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢是耐熱性最強的芽孢之一，通常作為驗證濕熱滅菌程序的生物指示劑，同時也是造成罐頭食品腐敗變質的主要微生物之一。芽孢的耐熱性除了與芽孢種類有關，還與所處的環境如酸鹼度，水分活度，無機鹽濃度等有著緊密的關係。