雜交瘤細胞

雜交瘤抗體技術的基本原理是通過融合兩種細胞而同時保持兩者的主要特徵。這兩種細胞分別是經抗原免疫的小鼠細胞與小鼠骨髓瘤細胞。脾淋巴細胞的主要特徵是它的抗體分泌功能和能夠在選擇培養基中生長，小鼠骨髓瘤細胞則可在培養條件下無限分裂、增殖，即所謂永生性。在選擇培養基的作用下，只有b細胞與骨髓瘤細胞融合的雜交細胞才具有持續增殖的能力，形成同時具備抗體分泌功能和保持細胞永生性兩種特徵的細胞，這種雜種細胞叫做雜交瘤細胞。

1）瘤細胞培養（無特殊要求）

骨髓瘤細胞呈懸浮或輕微附著形式生長，如附著性生長的細胞多時，用吸管輕輕吹打或輕輕叩擊培養容器即可分離下來。通常要維持細胞於指數生長期（細胞培養時間為15~20小時），56每3~5天取細胞0.2~1ml移入到10ml新培養液中，其最大細胞密度不能超過5×10~10/ml。一般使用含有高糖的DMEM培養液，並補加有pH的穩定劑HEPES。

2）免疫小鼠和脾細胞的製備

免疫小鼠：取6~8周齡Balb/C雌鼠，基礎免疫2周，靜脈再加強免疫一次，3~5天後用於融合。

脾細胞製備：1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。

2．無菌條件下取出脾臟，剃除結締組織和脂肪，用5ml無血清培養液沖洗一次。

3．把脾臟置於已消毒的90~100目不鏽鋼網或尼龍紗網中。

4．在脾中部切開一小口，用注射器芯從一端輕輕壓擠，再用無血清培養液沖洗，令細胞通過紗網，收集入平皿中，或用注射器向脾臟內注入3ml無血清培養液，反覆抽吸數次方法獲取細胞，再製成細胞懸液亦可。

5．把細胞懸液注入50ml離心管中，加10~20ml培養液，輕輕吹打數次，室溫中置5分鐘。

6．離心（800~1000轉/分）計數，備用。

3）飼細胞的製備：常用小鼠胸腺細胞或小鼠的腹腔細胞

飼細胞的製備：

小鼠腹腔細胞製備方法：

1．引頸處死小鼠，用酒精消毒表體。

2．切開腹部皮膚剝向兩側，暴露出腹壁。

3．用無菌7號針頭注射器，吸取3ml無血清培養液。

4．用小鑷夾起腹壁，注入3ml無血清培養液，用手反覆輕輕揉腹壁，再反覆抽吸3~5次。

5．收集末次吸得的細胞，注入50ml的離心管中，再加20ml無血清培養液，用吸管漂洗一次。

6．離心，去上清，用含血清培養基調節細胞濃度為2×105/ml，接種入培養板中，24孔板每孔加0.1ml。

4）細胞融合

HAT培養基的製備[貯備液成分]100×次黃嘌呤（Hypoxanthine:H）胸腺嘧啶核苷（Thymidine:T）氨基喋呤（Amiropterin:A）[HT貯備液製備貯備液製備]

1．稱取136.1mgH，38.8mgT。

2．依次溶解在100ml雙蒸水中，H難溶，可加溫50~80℃促溶。

3．用0.22微米濾膜濾過除菌，每瓶分裝2~5ml，-20℃冰箱貯存。

[A貯備液製備貯備液製備]

1．稱取17.6mgA到90ml雙蒸水中。

2．滴加1MNaOH溶液並不斷搖動，直至完全溶解，再滴加等量1MHCl溶液，恢復pH在7.0左右。3．補足雙蒸水至最終體積100ml。

4．0.22微米濾膜濾過除菌，分裝，-20℃冰箱貯存。使用時，每100ml培養液（含血清）加1mlHT貯備液和1mlA貯備液。1.0×10-2M1.6×10-3M4.0×10-5MPEG（誘導劑）的製備（30%~50%）

1．取分子量1000的PEG高壓蒸氣滅菌（6.8公斤，15分鐘）

2．56℃水浴中融化后，37℃水浴中溫浴。

3．取無血清培養液37℃水浴中溫浴（單獨）

4．配40%濃度時，用刻度吸管吸0.4mlPEG和0.6ml無血清培養液混合、37℃水中溫育備用。

細胞準備

1．收集骨髓瘤細胞，用無血清培養液洗3次（37℃），計數活力細胞（不少於90%）。

2．收集小鼠脾細胞，用無血清培養液洗3次（37℃），並計細胞數和測定活力細胞。

3．按1：5或1：10混合脾細胞和骨髓瘤細胞后，離心棄去上清，並以消毒濾紙吸凈多餘上清。

融合方法一：

1．將1ml40%的PEG液一滴滴加入到細胞團中，在60秒內加完，同時並不斷輕微轉動離心管或用手指輕彈離心管。

2．在不斷轉動離心管中加1ml無血清培養液，60秒鐘內加完。

3．於5分鐘內慢慢加完20ml無血清培養基。此時細胞對機械損傷非常敏感。

4．離心（800轉/分，8分鐘），去上清，用完全培養液10ml懸浮，輕輕混勻。

5．取96孔板，每孔加50微升。

6．取等體積細胞懸液，向另一96孔板中加50微升。

7．送入5%CO2溫箱中37℃培養，24小時后更換成HAT選擇性培養液。

方法二：

1．加0.2ml43%的PEG於離心管中。

2．用預先消毒的細玻璃針伸入管中輕輕攪動細胞團。

3．室溫中置2分鐘。

4．加入10ml完全培養液。

5．800轉/分離心5分鐘。

6．2倍HAT培養液培養懸浮細胞，24孔板，用取每孔中加0.5ml，96孔板每孔中加0.1ml。另7．5%CO2溫箱，37℃，一周后第一次更換培養液，培養板中預先接種有飼養細胞，加2×HAT選擇培養液與原等量培養液混合后，即成為1×的HAT培養基。

融合后細胞培養

1．融合后7~10天用HAT培養液變數換液，以後每隔2~3天半量換液一次。

2．兩周后可改用HT培養液半量換液，或仍用HAT培養液。

3．2~3周后出現雜交細胞集落，細胞個大，圓且透明。

4．待集落增殖生長至1/3孔時，應進行抗體檢測。

克隆化培養[軟瓊脂培養]

1．稱1g瓊脂粉，加入到100ml雙蒸水中，高壓蒸氣滅菌，4℃冰箱保存。

2．使用前，1%的瓊脂和2×的DMEM培養液在45℃水浴中分別溫浴。

3．二者等體積混合后，立即加入1.5×107小鼠脾細胞，混勻。

4．立即到入平皿中，每平皿（直徑10cm）加10ml，室溫中置15分鐘。

5．另取雜交瘤細胞懸液和0.5%瓊脂等體積混合（0.25%瓊脂），加2ml到預先鋪有底層瓊脂的瓶皿內。

6．CO2溫箱培養。

7．10~15天後，有細胞集落形成，適時移入24孔培養板中擴大培養。如用瓊脂糖，底層濃度為0.6%，上層為0.3%瓊脂。

[有限稀釋法]

1．製備有飼養細胞底層的細胞培養板。

2．收集細胞、計數陽性培養細胞。

3．細胞懸液調至5~10個細胞/ml。

4．96孔板中每孔加0.1ml。

5．CO2溫箱培養一周后，半量換液，繼續培養。

6．適時檢測每孔培養上清，挑選呈陽性培養孔的細胞繼續進行有限稀釋，直至確信孔中細胞為單克隆為止。

7．進行擴大培養。

5）抗體的檢測）常用方法：免疫熒光試驗、放射免疫試驗（RIA），酶聯免疫吸附試驗（ELISA）等。胞的篩選

ELISA法。首次檢測時間在細胞融合后10天左右進行。

ELISA法所需試劑配置

包被緩衝液(pH9.60.05M碳酸鹽緩衝液):

Na2CO31.59g

NaHCO3　2.93g

加蒸餾水至1000ml

洗滌緩衝液(pH7.40.15MPBS):

KH2PO4 0.2g

Na2HPO4·12H2O　2.9g

NaCl 8.0g

KCl　0.2g

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸餾水至1000ml

包被抗原：pH9.6碳酸鹽緩衝液（CBS）稀釋抗原，加入到酶標板中，100μL/孔，37℃2小時或4℃過夜。甩干，洗滌3次，3分鐘/次。

封閉（血清或脫脂奶粉）：此步有時用，有時不用。

加被檢樣品（一抗），100μL/孔，37℃半小時，甩干，洗滌3次，3分鐘/次。

加酶標抗體（二抗），100μL/孔，37℃半小時，甩干，洗滌3次，3分鐘/次。

顯色：5ml的顯色A液,5ml的顯色B液，100μL/孔，37℃反應10～20分鐘。

終止反應：加2MH2SO4，50μL/孔。

結果判定。肉眼或用酶標儀在450nm波長下測定OD值。

本實驗室目前採用洗板機進行洗滌。