體細胞胚

體細胞胚在自然界中早已存在，不過用人工培養的方法誘導營養器官產生胚，卻是在二十多年前首次出現的新事物。1958年德國的Reinert在固體培養基上培養胡蘿蔔的根，發現愈傷組織中有些細胞可以發育成胚。同年，美國Steward等人用懸浮培養的方法，培養胡蘿蔔的塊根細胞，也得到同樣的體細胞胚。

他們的工作，引起了世界各國的廣泛注意，因為從理論上看，體細胞胚的發生向發育生理學提出了新問題，同時它有力地證明了體細胞同生殖細胞一樣也具有遺傳上的全能性。從實踐上看，體細胞胚的誘導成功，為現代化的非常規育種方法提供了理論基礎，人們已可以設想將植物體分離成各個單細胞(例如現在的原生質體培養)，然後採用類似微生物中誘導突變及篩選突變的方法，從分離的體細胞中獲得新的優良變異，再通過誘導體細胞胚的途徑，使生成完整的植株，來培養新的品種，這種方法將是植物育種工作中的一次革命。

據Wetherell1978年的報道，已有 80種植物能誘導產生體細胞胚，這80種植物分屬於33個不同的科，不過據作者最近所得的情報，有些糧食作物，如高粱、穀子也已獲得體細胞胚，因此可以認為體細胞胚胎髮生在植物界中是一種廣泛存在的現象。

上面已說過體細胞胚是一種非合子胚，根據其來源的不同可分成四種類型：

(1)從植物體中營養器官的細胞發育成的胚，如胡蘿蔔根及咖啡葉經愈傷組織發育成的胚。

(2)從成年植株的珠心細胞及未成熟或已成熟的胚細胞等所發生的體細胞胚，如茄子和苣買菜的胚細胞，甜橙和四季桔(Citrus microcarpa)的珠心細胞經愈傷組織所發生的胚。

(3)胚囊中的細胞及花粉粒，常常也可以發生胚，這種胚應該是單倍體。嚴格地說，胚囊中的細胞除卵細胞以外，應屬於配子體細胞。由花粉粒培養所發生的胚，有人認為是未經分裂的花粉粒反覆分裂成愈傷組織后所產生，也有人認為是花粉粒分裂后，所產生的營養核經愈傷組織階段后發生的，後者很明顯也應屬於體細胞胚。

(4)上面三種體細胞胚，都需要經過愈傷組織階段，而有的體細胞胚可從幼株的下胚軸或子葉上直接產生，如在白菜、曼陀羅、毛茛和高粱中可以見到。

誘導體細胞胚胎髮生的程序，因植物種類和取材部位的不同而異，但一般可分為以下幾個步驟：

1．取植物的一部分組織(如根、莖、葉的切段或胚等)，用組織培養的方法，先讓這些高度分化的組織細胞脫分化，形成愈傷組織，再加以人工培養使其再分化，這個階段一般採用固體培養方法比液體培養方法好，通常所採用的脫分化試劑是2,4-D，也有採用與2,4-D相類似的生長素藥劑(由於2,4-D容易誘發生物包括人體細胞的突變，用時宜謹慎)。有的植物除2,4-D以外，還需要附加少量的細胞分裂素，至於2,4-D的濃度，則因植物而異，一般宜採用較高的濃度。外植體的年齡也很重要，一般幼齡組織因其分化程度較低而較容易產生愈傷組織。

2．用所得的愈傷組織進行懸浮培養，使細胞分散；或者進行固體培養，搖床培養等。

3．將懸浮培養物倒在沒有植物激素的固體平面培養基上，再進行固體培養，其中有些胚性細胞就有可能發生體細胞胚。

4.培養愈傷組織時應避光。

Halperin與Wetherell(1964)首先認為生長素是誘導體細胞胚胎髮生的主要控制因子，所用生長素的種類，因植物種類而異。從大多數的報道看，一般都採用2，4-D，但也有例外，如 Jelaska(1974)在南瓜體細胞胚的誘導中，採用NAA與IBA(吲哚丁酸)，效果顯著好於2，4-D。Mullins等(1976)在葡萄中所用的激素是β-萘氧乙酸(β-NOA濃度為 5—25μM)及苄基腺嘌呤(BAP濃度為5—10μM)。Hidmichi．M．等(1979)在茄子下胚軸中用的是NAA，濃度為 8.0mg/l。

有人研究體細胞胚胎髮生中不同階段與生長素之間的關係，認為在誘發產生胚性細胞時，需要高濃度的生長素，當胚性細胞經球形胚、心形胚、魚雷形胚等不同階段發育成為成熟胚的過程中，所要求的生長素濃度要低，而成熟胚在發育成植株時則完全不需要生長素。從胚性細胞到植株這一發育過程中，生長素濃度過高，反而會抑制體細胞胚的發育或產生畸形胚。

最近國外在柑桔、白菜和胡蘿蔔的組織培養中發現一些愈傷組織，不需要任何外源激素就能繼代培養，併發生體細胞胚。我國在甘蔗、葡萄等植物中，也發現過類似的情況，這種組織叫做馴化組織。馴化組織很可能是在培養過程中發生的一種突變細胞，它們在激素方面具有自養的能力，也就是說馴化組織的細胞能合成本身所需要的內源激素。

多數研究者認為供應愈傷組織以充足的還原氮是體細胞胚胎髮生的第二個基本條件。Halperin(1966)首先認為體細胞胚胎髮生需要還原氮。Wetherell與Dougall(1976)根據他們的研究證實了Halperin的看法，他們以濃度為5—55mM的硝酸鹽作唯一氮源時，每培養物平均只發生一個胚，當培養基中加入0.1mM的氯化銨時就能促進胚的形成，如用40 mM硝酸鉀及30mM氯化銨這一配比，對愈傷組織的生長及胚胎髮生都比較合適。他們還認為谷氨胱胺與丙氨酸能作為胚胎髮生與生長的唯一氮源。最近 Dougall與 Verma(1978)證明，如果能在培養過程中控制pH，使其保持在5.4左右，那麼野生胡蘿蔔的懸浮培養能以氨作為唯一氮源。

顯然，許多植物在體細胞胚生成過程中都需要還原氮，但也有例外，如芹菜就不需要還原氮。

通常認為細胞分裂素是體細胞胚胎髮生的抑製劑，然而已有實例證明，這種意見至少並不具有普遍意義。在某些實例中，細胞分裂素甚至對體細胞胚胎髮生能起促進作用，而且不同的細胞分裂素其作用也不盡相同，例如低濃度的玉米素，能刺激胡蘿蔔懸浮培養液中的胚胎髮生，但相應濃度的激動素或BAP卻抑制此過程，而在芹菜中，情況恰好相反，低濃度的激動素能促進其胚胎髮生。

一般認為高濃度的鉀，能促進愈傷組織的組織化程度，因此常有利於胚胎髮生。

另外，steward等人還認為在自然情況下，合子胚一般在子房內發育，其環境是黑暗，而且空氣不太流通，因此給於這樣條件也有利於體細胞胚的發生與發育。

一般說來體細胞胚一旦發生，不需要進一步處理，在無任何外源激素的條件下就能自行成熟。培養基中若有生長素殘留反而會使胚發育異常，但也有些植物卻要求在培養基中具有一定的外源激素，例如葡萄體細胞胚的成熟就需要濃度為1μM的GA3 和5μM的2ip(異戊烯基腺嘌呤)。

有人認為蔗糖濃度對胚的發生和成熟也有很大影響，在誘導體細胞胚發生時需要高濃度的糖，但在體細胞胚成熟時卻需要相應地降低糖的濃度。 Neuman與 de Garcia(1974)認為培養基中糖的濃度超過2%時就不利於胚的成熟。

此外，用6℃左右的低溫處理，常常對有些植物體細胞胚的成熟有利。

關於體細胞胚胎髮生的生化過程研究很少，而體細胞胚發生的本質卻需要詳細研究生化過程才能加以揭露。從事生化研究的困難在於必須使體細胞胚在培養過程中能大量發生，而且又要使同一培養物中體細胞胚的發育過程能盡量同步，這兩個先決條件，目前已開始在胡蘿蔔的培養中設法做到，所以現在已有人利用胡蘿蔔為材料，研究體細胞胚胎髮生過程中蛋白質、RNA與DNA的變化。最近Sung等(1980)將胡蘿蔔未發生體細胞胚的愈傷組織和已發生胚的愈傷組織作了比較，發現有二種特殊的胚性蛋白質決定體細胞胚的發育過程，這兩種蛋白質的作用機理究竟是什麼？還有待深入研究。