分光光度技術

一、光的基本知識

光是由光量子組成的，具有二重性，即不連續的微粒和連續的波動性。是光的，可用下式表示：

C

λ=───

V

式中λ為波長，具有相同的振動相位的相鄰兩點間的距離叫波長。V為頻率，即每秒鐘振動次數。C為光速等於299770千米/秒。光屬於電磁波。自然界中存在各種不同波長的電磁波，列成表1-1所示的波譜圖。分光光度法所使用的光譜範圍在200nm-10μ（1μ= 1, 000nm ）之間。其中，400nm－760nm為可見光區，760nm－10,000nm為紅外光區。

二、朗伯－比爾（Lambert-Beer）定律

朗伯－比爾定律是比色分析的基本原理，這個定律是有色溶液對單色光的吸收程度與溶液及液層厚度間的定量關係。此定律是由朗伯定律和比爾定律歸納而得。

1.朗伯定律

一束單色光通過溶液后，由於溶液吸收了一部分光能，光的強度就要減弱：若溶液濃度不變，則溶液的厚度愈大（即光在溶液中所經過的途徑愈長），光的強度減低也愈顯著。

2.朗伯－比爾定律

如果同時考慮吸收層的厚度和溶液濃度對光吸收的影響，則必然將朗伯定律和比爾定律合併起來，吸光度與溶液的濃度和液層的厚度的乘積成正比，這就是朗伯－比爾定律。

能從含有各種波長的混合光中將每一單色光分離出來並測量其強度的儀器稱為分光光度計。

分光光度計因使用的波長範圍不同而分為紫外光區、可見光區、紅外光區以及萬用（全波段）分光光度計等。無論哪一類分光光度計都由下列五部分組成，即光源、單色器、狹縫、樣品池，檢測器系統。

一、光源

要求能提供所需波長範圍的連續光譜，穩定而有足夠的強度。常用的有白熾燈（鎢比燈、鹵鎢燈等），氣體放電燈（氫燈、氘燈及氙燈等），金屬弧燈（各種汞燈）等多種。

鎢燈和鹵鎢燈發射320－2000nm連續光譜，最適宜工作範圍為360－1000nm，穩定性好，用作可見光分光光度計的光源。氫燈和氘燈能發射150－400nm的紫外結，可用作紫外光區分光光度計的光源。紅外線光源則由納恩斯特（Nernst）棒產生，此棒由ZrO2:Y2O3=17:3（Zr為鋯，Y為釔）或Y2O3，GeO2（Ge為鈰）及ThO2

（Th為釷）之混合物製成。汞燈發射的不是連續光譜，能量絕大部分集中在253.6nm波長外，一般作波長校正用。鎢燈在出現燈管發黑時應及更換，如換用的燈型號不同，還需要調節燈座的位置的焦距。氫粘及氘燈的燈管或窗口是石英的，且有固定的發射方向，安裝時必須仔細校正接觸燈管時應戴手套以防留下污跡。

二、分光系統（單色器）

單色器是指能從混合光波中分解出來所需單一波長光的裝置，由稜鏡或光柵構成。用玻璃製成的稜鏡色散力強，但只能在可見光區工作，石稜鏡工作波長範圍為185￣4000nm，在紫外區有較好的分辯力而且也適用於可見光區和近紅外區。稜鏡的特點是波長越短，色散程度越好，越向長波一側越差。所以用稜鏡的分光光度計，其波長刻度在紫外區可達到0.2nm，而在長波段只能達到5nm。有的分光光系統是衍射光柵，即在石英或玻璃的表面上刻劃許多平行線，刻線處不透光，於是通過光的干涉和衍射現象，較長的光波偏折的角度大，較短的光波偏折的角度小，因而形成光譜。

三、狹縫

狹縫是指由一對隔板在光通路上形成的縫隙，用來調節入射單色光的純度和強度，也直接影響分辯力。狹縫可在0－2mm寬度內調節，由於稜鏡色散力隨波長不同而變化，較先進的分光光度計的狹縫寬度可隨波長一起調節。

四、比色環

比色環也叫樣品池，吸收器或比色皿，用來盛溶液，各個杯子壁厚度等規格應儘可能完全相等，否則將產生測定誤差。玻璃比色杯只適用於可見光區，在紫外區測定時要用石英比色杯。不能用手指拿比色杯的光學面，用后要及時洗滌，可用溫水或稀鹽酸，乙醇以至鉻酸洗液（濃酸中浸泡不要超過15分鐘），表面只能用柔軟的絨布或拭鏡頭紙擦凈。

五、檢測器系統

有許多金屬能在光的照射下產生電流，光愈強電流愈大，此即光電效應。因光照射而產生的電流叫做光電流。受光器有兩種，一是光電池，二是光電管。光電池的組成種類繁多，最常見的是硒光電池。光電池受光照射產生的電流頗大，可直接用微電流計量出。但是，當連續照射一段時間會產生疲勞現象而使光電流下降，要在暗中放置一些時候才能恢復。因此使用時不宜長期照射，隨用隨關，以防止光電池因疲勞而產生誤差。

光電管裝有一個陰極和一個陽極，陰極是用對光敏感的金屬（多為鹼土金屬的氧化物）做成，當光射到陰極且達到一定能量時，金屬原子中電子發射出來。光愈強，光波的振幅愈大，電子放出愈多。電子是帶負電的，被吸引到陽極上而產生電流。光電管產生電流很小，需要放大。分光光度計中常用電子倍增光電管，在光照射下所產生的電流比其他光電管要大得多，這就提高了測定的靈敏度。

檢測器產生的光電流以某種方式轉變成模擬的或數字的結果，模擬輸出裝置包括電流表、電壓表、記錄器、示波器及與計算機聯用等，數字輸出則通過模擬/數字轉換裝置如數字式電壓表等。

一、測定溶液中物質的含量

可見或紫外分光光度法都可用於測定溶液中物質的含量。測定標準溶液（濃度已知的溶液）和未知液（濃度待測定的溶液）的吸光度，進行比較，由於所用吸收池的厚度是一樣的。也可以先測出不同濃度的標準液的吸光度，繪製標準曲線，在選定的濃度範圍內標準曲線應該是一條直線，然後測定出未知液的吸光度，即可從標準曲線上查到其相對應的濃度。

含量測定時所用波長通常要選擇被測物質的最大吸收波長，這樣做有兩個好處：⑴靈敏度大，物質在含量上的稍許變化將引起較大的吸光度差異；⑵可以避免其它物質的干擾。

二、用紫外光譜鑒定化合物

使用分光光度計可以繪製吸收光譜曲線。方法是用各種波長不同的單色光分別通過某一濃度的溶液，測定此溶液對每一種單色光的吸光度，然後以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標繪製吸光度──波長曲線，此曲線即吸收光譜曲線。各種物質有它自己一定的吸收光譜曲線，因此用吸收光譜曲線圖可以進行物質種類的鑒定。當一種未知物質的吸收光譜曲線和某一已知物質的吸收光譜曲線開關一樣時，則很可能它們是同一物質。一定物質在不同濃度時，其吸收光譜曲線中，峰值的大小不同，但形狀相似，即吸收高峰和低峰的波長是一定不變的。紫外線吸收是由不飽和的結構造成的，含有雙鍵的化合物表現出吸收峰。紫外吸收光譜比較簡單，同一種物質的紫外吸收光譜應完全一致，但具有相同吸收光譜的化合物其結構不一定相同。除了特殊情況外，單獨依靠紫外吸收光譜決定一個未知物結構，必須與其它方法配合。紫外吸收光譜分析主要用於已知物質的定量分析和純度分析。

每種物質都具有其特異的吸收光譜，不同物質由於其分子結構不同，對不同波長線的吸收能力也不同。分光譜來鑒定物質性質及含量的技術，分光光度技術理論依據是指利用物質特有的Lambert-Beer定律。