甲基化酶

Dam 甲基化酶

Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。一些限制酶（PvuⅡ, BamHⅠ、BclⅠ、BglⅡ、XhoⅡ、MboⅠ、 Sau3AⅠ）的識別位點中含 GATC 序列，另一些酶 ClaⅠ（1/4）、 XbaⅠ（1/16）、TaqⅠ（1/16）、MboⅠ（1/16）、 HphⅠ（1/16）的部分識別序列含此序列，如平均 4 個 ClaⅠ 位點（ATCGATN）中就有一個該序列。

有些限制酶對 Dam 甲基化的 DNA 敏感，不能切割相應的序列，如 BclⅠ、 ClaⅠ、 XbaⅠ 等。對甲基化不敏感的有 BamHⅠ、 Sau3AⅠ、 BglⅡ、 PvuⅠ 等。 MboⅠ 和 Sau3AⅠ 識別和切割位點相同，但其差異就在於前者對甲基化敏感。

一般哺乳動物 DNA 不會在腺嘌呤 N6 上甲基化，因此對甲基化敏感的限制酶切割這些 DNA 不會受到影響。當需要在這些敏感位點上完全切割 DNA 時，可利用 dam- E.coli 擴增並提取 DNA。

Dcm 甲基化酶

Dcm 甲基化酶識別 CCAGG 或 CCTGG 序列，在第二個胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受 Dcm 甲基化作用影響的酶有 EcoRⅡ（↓CCWGG）。大多數情況下，其同裂酶 BstNⅠ（CC↓WGG）可避免這一影響，因為二者識別序列雖然相同，但切點不同。

受此甲基化酶影響的酶還有 Acc65Ⅰ、 AlwNⅠ、 ApaⅠ、EcoRⅡ 和 EaeⅠ 等。不受此甲基化影響酶有 BanⅡ、 Bg1Ⅰ、 BstNⅠ、 KpnⅠ 和 NarⅠ 等。

EcoKⅠ 甲基化酶

EcoKⅠ 甲基化酶的識別位點少，識別 AAC（N）6GTGC 和 GCAC（N）6GTT 序列中 A 的 N6 位置。但因為識別位點少（1/8kb），所以研究較少。

SssⅠ 甲基化酶

SssⅠ 甲基化酶來自原核生物 Spiroplasma ，可使 CG 序列中的 C 在 C5 位置上甲基化。甲基化的模板可以是甲基化或半甲基化鏈（新合成鏈）的 DNA 鏈。 SssⅠ 甲基化的 DNA 受 E.coli 中 mcrA、 mcrBC、 mrr 系統的限制。許多酶對此甲基化敏感，如 AatⅡ、 ClaⅠ、 XhoⅠ、 SalⅠ 等，也有不敏感的，如 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 SphⅠ 和 KpnⅠ。

E.coli 中至少有 3 種依賴於甲基化的限制系統 mcrA、 mcrBC 和 mrr ，它們識別的序列各不相同，但只識別經過甲基化的序列，都限制由 CpG 甲基化酶（M SssⅠ）作用的 DNA （限制即消化降解）。 Mrr 限制 m6A ； McrA 限制 HpaⅡ 甲基化修飾的位點； McrBC 切割兩套半位點（G/A）mC ，這兩套位點之間間隔 2kb ，最適為 55～103bp ，需 GTP ；大多數常用的 E.coli 都含這三個限制系統中的一個或幾個，三個都不限制 Dcm 修飾的位點，Mrr不限制 dam、 EcoKⅠ、 EcoRⅠ 修飾的位點。

修飾酶切位點

HincⅡ 可識別四個位點（GTCGAC、 GTCAAC、 GTTGAC 和 GTTAAC），甲基化酶 M.TaqⅠ 可甲基化 TCGA 中的 A ，所以 M.TaqⅠ 處理 DNA 后， GTCGAC 將不受 HincⅡ 切割。

M.MspⅠ 修飾的產物為 m5CCGG ，在 BamHⅠ 識別位點（GGATCC）前面如果為 CC 或後面為 GG ，那麼經 M.MspⅠ 處理的 DNA （GGAT m5CCGG）對 BamHⅠ 不敏感（即抵抗切割）。

構建 DNA 文庫時，用 AluⅠ（AG↓CT）和 HaeⅢ（GG↓CC）部分消化基因組 DNA 后，將得到的片段用 M.EcoRⅠ 甲基化酶處理，然後加上合成的 EcoRⅠ 接頭，再用 EcoRⅠ 來切割時只有接頭上的位點可被切割，從而保護基因組片段。

產生新的酶切位點

通過甲基化修飾可產生新的酶切位點。 DpnⅠ 是依賴甲基化的限制酶， TCGATCGA 受 M.TaqⅠ 處理后形成甲基化（A）產物 TCG*ATCG*A ，其中 G*ATC 即為 DpnⅠ 位點。

對基因組作圖的影響

在研究哺乳動物 m5CG 、植物 m5CG 和 m5CNG 、腸道細胞 Gm6ATC 的甲基化水平和分佈時，利用限制酶對甲基化的敏感性差異，大有作為。

目的調查國內6個省市25家醫院臨床分離鮑曼不動桿菌中介導高水平氨基糖苷類抗生素耐葯的16SrRNA甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB的分佈情況。方法收集2004年12月-2005年12月國內6省市8家省級醫院、浙江省11個地區17家市級醫院臨床分離的700株鮑曼不動桿菌。瓊脂稀釋法測定其對妥布黴素、阿米卡星、慶大黴素、異帕米星、奈替米星5種氨基糖苷類抗生素的最低抑菌濃度（MIC）值；PCR篩選三種甲基化酶基因armA、rmtA、rmtB，克隆測序明確基因型；脈衝場凝膠電泳（PFGE）分析菌株的同源性；質粒抽提、接合試驗及Southern雜交確定armA基因定位。結果對阿米卡星、慶大黴素、異帕米星、奈替米星的耐葯率分別為67．7%、70．9%、75．7%、63．5%和71．5%。對5種氨基糖苷類抗生素全部耐葯的菌株有377株，其中334株檢出armA基因；未發現rmtA、rmtB陽性菌株。armA基因陽性菌株PFGE分型以A、B、C為主。鹼裂解法反覆抽提未得到質粒，多次接合試驗未成功；Southern雜交顯示，armA基因分別位於克隆A、B、c菌株染色體ApaⅠ酶切PFGE約220、300、220kb大小的PFGE片段上。結論16SrRNA甲基化酶基因armA在鮑曼不動桿菌中廣泛存在，armA基因位於鮑曼不動桿菌的染色體上。