位點特異性重組

site-specific recombination 位點特異性重組：重組的一類，只發生在特異DNA區域，有短的同源順序，重組的蛋白不是rec 系統而是int 等，如噬菌體l 的定點插入。

同源重組一般都在染色體內仍按DNA序列的原來排列次序。但是在所謂位點特異性重組（site-specific recombination）中，DNA節段的相對位置發生了移動，從而得到不同的結果─DNA序列發生重排。位點特異性重組不依賴於DNA順序的同源性（雖然亦可有很短的同源序列），而依賴於能與某些酶相結合的DNA序列的存在。這些特異的酶能催化DNA鏈的斷裂和重新連接，它們能發動位點特異性重組作用.而在同源重組中，DNA鏈的切斷完全是隨機的，結果暴露出一些能與RecA這樣的蛋白質相結合的順序，從而發動交叉重組。λ噬菌體DNA能通過重組作用整合進E.coli染色體的特異位點，成為前病毒（provirus，或稱前噬菌體，prophage）。λ的整合作用有兩個特點：①這種交換是可逆的，原先存在的DNA順序全部被保存下來，並無丟失；②噬菌體和細菌的DNA之間有一段很短的同源序列，重組交換必須通過其中的一個特定的核苷酸。這兩個特點也就是位點特異性重組的共同特點。

λ噬菌體編碼λ整合酶（integrase）。這個酶能指導噬菌體DNA插入E.coli染色體中。這種插入作用是通過兩個DNA分子的特異位點進行重組，將兩個環狀DNA分子變成一個大環。在噬菌體感染的早期即有大量整合酶產生，故幾乎所有被感染的細胞都發生整合作用。這種作用可用體外模型來進行實驗。用四種成份混合起來組成反應系統：純的整合酶；來自E.coli的一種輔助蛋白，稱為整合作用宿主因子（IHF，integration host factor）；鎂離子；和含有噬菌體和細菌DNA發生重組交叉的特異位點（稱為attP和attB，att源自attachment）的DNA片段。

對於這個DNA片段，一個簡單的製備方法就是人工構建含attP和attB兩者質粒。當整合反應發生時，即在attP和attB處發生交叉重組，產生兩個較小的環狀DNA。整合反應由整合酶催化，其步驟是彼此偶聯的：四條鏈同時被切斷、交叉和重新連接起來，其間沒有發現任何穩定的中間產物。這種前文提到的拓撲異構酶Ⅱ的反應很相似，即DNA雙鏈同時被切斷，然後磷酸二酯鍵又重新連接起來，並不需要ATP供應能量。故整合酶實際上能起拓撲異構酶的作用，可使帶有att位點（或類似序列）的超螺旋鬆弛。並且和拓撲異構酶一樣，整合酶也產生交錯的斷裂（staggeredcut）:有七個核苷酸的單鍵尾端，形成所謂粘性末端。

整合酶和IHF在att上都有特定的結合位點，體外實驗也證明這兩種蛋白質結合在attDNA的特定位點上。每一次重組過程需要20－40個整合酶分子及約70個IHF分子。故可能這兩種蛋白質不僅是作為酶（發揮催化作用），而且在每次重組中都要形成某種複合物結構。通過缺失實驗，證明attP至少要約250bp長，太短將使其功能喪失，而attB則較短，包括核心（core）在內約23bp長即有功能。長250bp的整個attP可繞在整合酶分子的周圍，類似核小體的結構，其中含有約8個整合酶的單體，每個的分子量約為40000。attB和attP中有相同的15bp的核心序列。整合酶與兩個核心都相結合。如果兩個核心中有一個的順序有所改變，則重組的效率將大為降低。但是如果兩個核心序列發生了相同的改變，則順序交換仍能進行。可見整合酶不但要求特異的序列，而且要求兩個核心序列有同源性。

然而，如果λ前病毒受到誘導（induction），則整合作用將被逆轉。此過程稱為切出（excision）。切出后，細菌和噬菌體DNA恢復至原來完整狀態。前病毒受到誘導時即產生又一種蛋白質，稱為切出酶（excisionase）。切出酶和整合酶一起催化前病毒DNA兩端的雜種att位點之間的重組。這時，整合酶和切出酶一同緊密結合在細菌前病毒雜種att位點上，顯然這樣就能促使反應向反方向進行。

λ噬菌體的整合和切出過程。attB由稱為BOB’的序列組成，而attP由POP'組成。O是核心序列，是attB和attP所共同的。而其兩側的序列是B，B’和P，P’，被稱為臂。噬菌體DNA是環狀的，重組時被整合入細菌染色體中，成為線性序列。前病毒的兩側是兩個新的雜種att位點，左側稱為attL，由BOP’組成，而右側為attR，由POB’組成。可見，整合和切出並不涉及相同的一對序列：整合需要識別attP和attB，而切出要求識別attL和attR。因此，重組位點的識別就決定了位點專一性重組的方向──整合或切出。雖然位點專一重組是可逆的，但反應的方向取決於不同環境條件，這對決定噬菌體的生命力周期是非常性重要的。整合的。整合酶和IHF對整合和切出都是是必需的，而切出酶在控制反應方向上起重要作用──它對切出是必須的，但能抑制整合。在切除的環化過程中如果發生錯誤，前噬菌體可能失去某些基因而代之以其相鄰的細菌基因。因為整合位點處於細菌染色體的gal和bio基因之間，切除過程中噬菌體DNA偶而會帶走gal基因，生成λgal（或稱λdb）。λgal或λbio轉導（感染）新的宿主時常常把gal或bio基因帶到新的宿主中去，所以把λgal或λbio這些帶有某些宿主基因的噬菌體稱為轉導噬菌體（transducing phage）。

如果一個DNA分子上兩個特異位點之間發生重組，其後果有兩種可能性：兩個位點之間的節段或被丟失，或被顛倒。有些生物能夠利用這種重組倒置來控制基因的表達。因為DNA的一正一倒兩種排列法可以相應地表達兩種不同的蛋白質，細胞就可根據需要作出選擇。奇怪的是，利用這種機制所調節的蛋白質往往都位於生物的體表。例如噬菌體Mu的尾蛋白即由其可倒置的DNA節段gin所控制。最著名的例子是沙門氏菌（如鼠傷寒沙門氏菌，Salmonellatyphimurium）的鞭毛抗原。而錐蟲（trypanosomes）的表面抗原更是千變萬化，用以逃脫宿主免疫系統的攻擊，這也是通過一系列DNA重排達到的，其複雜程度有點類似於抗體基因的結構。沙門氏菌的位相是由於它的兩種鞭毛蛋白質H1和H2的交迭表達。在某一時期，菌體表達其中的一種，但從不兩種均表達。H2基因的啟動子位於此基因近旁的一個970bp長的DNA節段（稱為hin基因）上，在啟動子兩端各有一個14bp的反向重複序列（IRL和IRR）。當兩個反向位點之間進行重組交叉時，位點之間的節段將被顛倒。

這兩個14bp的反向重複即可用作為核心序列進行位點特異性重組。當此970bp節段朝向某一方向時，啟動子即在H2基因的旁邊，故H2基因即被轉錄。同時，鄰近一編碼阻抑蛋白的基因亦被轉錄，產生的阻抑蛋白可抑制遠方H1基因的表達。因而結果是H2表達而H1不表達。相反，如此970bp節段朝向另一方向，H2基因即不被表達，因為沒有了啟動子。但同時H1的阻抑蛋白也不再表達，故H1遂得以表達。這個hin基因編碼的蛋白質稱為Hin酶，此酶就是用以催化倒置（位點特異性重組）的。有人認為，當細胞的生長受到阻礙時，Hin酶的表達就會增高，以便更換一種新的表面抗原。

噬菌體Mu中的類似系統位於其基因組的右端。這個可倒置的G節段長約3kb，在不同的MuDNA中有不同的方向。當噬菌體生長在E.coliK12中的，感染是溶菌體的。此時G節段的方向稱為G（+）。在節段前方的gin基因對G節段的反向反應是必須的。在噬菌體P1中也有一個類似的cin基因，對其C節段的反向反應是必須的。G節段中的基因編碼噬菌體吸附在菌細胞表面上所必須的蛋白質。而G節段的方面控制著這些基因的表達。其結果是G（+）和G（-）噬菌體對不同株E.coli有不同的特異性。在G（+）方向，基因S和U表達，其產物使噬菌體可吸附在E.coliK12上，但不能吸附在E.coliC上，反之，在G（-）方向，基因S’和U’表達，噬菌體可吸附在E.coliC上，而不能吸附在E.coliK12上。各蛋白質的分子量為：S56000，U21000，S’48000，和U’26000。一個特殊的發現是它們的綜合長度（S＋U或S’＋U’）所需的編碼序列大約要4kb長，要比G節段長得多。

這兩套基因編碼在DNA的兩條互補鏈上，而它們的共同啟動子則位於則位於反向區的左側。後者長度過短的解釋是S和S’蛋白有一個共同的N端序列（Sc），Sc序列不由反向區編碼。而兩者不同的C端序列Sv和S'v的表達則決定於反向區的方向。U和U’基因則是獨立編碼的。

Mu噬菌體的gin和沙門氏菌的hin的功能相似，它們在體外實驗中甚至可互相替代。在E.coli中也有一類基因，稱為pin。它能促使其鄰接的約7800bp長的DNA節段倒置。在這個可倒置節段的兩端有29bp長的反向重複。現在尚不了解這個反應有何功能。

在體外亦可進行Gin或Hin介導的倒置反應，但還額外需要：①一個宿主編碼的末知蛋白質和②底物DNA必須具有超螺旋。另外，底物DNA上除重組位點外還要一段約60bp的DNA序列，這個序列可位於底物分子上任何部位（除了十分靠近重組位點外）。此序列位置的任意性似乎與轉錄作用中的增強子類似，故有人稱之謂重組增強子。