分子克隆

克隆(clone,clon)一詞源於希臘文Klon，原意為樹木的枝條。在生物學中其名詞含義系指一個細胞或個體以無性繁殖的方式產生一群細胞或一群個體，在不發生突變的情況下，具有完全相同的遺傳性狀，常稱無性繁殖(細胞)系；其動詞(clone,cloned,cloning)含義指在生物體外用重組技術將特定基因插入載體分子中，即分子克隆技術。研究基因的第一步是分離它並獲得許多與它完全相同的拷貝。這稱為“克隆”基因。一個基因被克隆的過程稱為 分子克隆。

分子克隆是指分離一個已知DNA序列，並以 in vivo（活體內）方式獲得許多複製品的過程。這一複製過程經常被用於增加並獲取DNA片段中的基因，但也可用來增加某些任意的DNA序列，如啟動子、非編碼序列、化學合成的寡核苷酸或是隨機的DNA片斷。

將DNA片段(或基因)與載體DNA分子共價連接，然後引入寄主細胞，再篩選獲得重組的克隆，按克隆的目的可分為DNA和cDNA克隆兩類。

cDNA克隆是以mRNA為原材料，經體外反轉錄合成互補的DNA(cDNA)，再與載體DNA分子連接引入寄主細胞。每一cDNA反映一種mRNA的結構，cDNA克隆的分佈也反映了mRNA的分佈。特點是：

①有些生物，如RNA病毒沒有DNA，只能用cDNA克隆；

②cDNA克隆易篩選，因為cDNA庫中不包含非結構基因的克隆，而且每一cDNA克隆只含一個mRNA的信息；

③cDNA能在細菌中表達。cDNA僅代表某一發育階段表達出來的遺傳信息，只有基因文庫才包含一個生物的完整遺傳信息。

常用以下方法獲得DNA片段：①用限制性核酸內切酶將高分子量DNA切成一定大小的DNA片段；②用物理方法(如超聲波)取得DNA隨機片段；③在已知蛋白質的氨基酸順序情況下，用人工方法合成對應的基因片段；④從mRNA反轉錄產生cDNA。

①質粒：質粒是細菌染色體外遺傳因子，DNA呈環狀，大小為1-200千鹼基對(kb)。在細胞中以遊離超螺旋狀存在，很容易製備。質粒DNA可通過轉化引入寄主菌。在細胞中有兩種狀態，一是“緊密型”；二是“鬆弛型”。此外還應具有分子量小，易轉化，有一至多個選擇標記的特點。質粒型載體一般只能攜帶10kb以下的DNA片段，適用於構建原核生物基因文庫，cDNA庫和次級克隆。

②噬菌體DNA：常用的λ噬菌體的DNA是雙鏈，長約49kb，約含50個基因，其中50%的基因對噬菌體的生長和裂解寄主菌是必需的，分佈在噬菌體DNA兩端。中間是非必需區，進行改造后組建一系列具有不同特點的載體分子。λ載體系統最適用於構建真核生物基因文庫和cDNA庫。

M13噬菌體是一種獨特的載體系統，它只能侵襲具有F基因的大腸桿菌，但不裂解寄主菌。M13DNA(RF)在寄主菌內是雙鏈環狀分子，象質粒一樣自主複製，製備方法同質粒。寄主菌可分泌含單鏈DNA的M13噬菌體，又能方便地製備單鏈DNA，用於DNA順序分析、定點突變和核酸雜交。

③柯斯(Cos)質粒：是一類帶有噬菌體DNA粘性末端順序的質粒DNA分子。是噬菌體－質粒混合物。此類載體分子容量大，可攜帶45kb的外源DNA片段。也能象一般質粒一樣攜帶小片段DNA，直接轉化寄主菌。這類載體常被用來構建高等生物基因文庫。

DNA分子與載體分子連接是克隆過程中的重要環節之一，方法有：①粘性末端連接，DNA片段兩端的互補鹼基順序稱之為粘性末端，用同一種限制性內切酶消化DNA可產生相同的粘性末端。在連接酶的作用下可恢復原樣，有些限制性內切酶雖然識別不同順序，卻能產生相同末端。②平頭末端連接，用物理方法製備的DNA往往是平頭末端，有些酶也可產生平頭末端。平頭DNA片段可在某些DNA連接酶作用下連接起來，但連接效率不如粘性末端高；③同聚寡核苷酸末端連接。④人工接頭分子連接，在平頭DNA片段末端加上一段人工合成的、具有某一限制性內切酶識別位點的寡核苷酸片段，經限制性內切酶作用后就會產生粘性末端。

連接反應需注意載體DNA與DNA片段的比率。以λ或Cos質粒為載體時，形成線性多連體DNA分子，載體與DNA片段的比率高些為佳。以質粒為載體時，形成環狀分子，比率常為1∶1。

常用兩種方法：①轉化或轉染，方法是將重組質粒DNA或噬菌體DNA(M13)與氯化鈣處理過的宿主細胞混合置於冰上，待DNA被吸收后鋪在平板培養基上，再根據實驗設計使用選擇性培養基篩選重組子，通常重組分子的轉化效率比非重組DNA低，原因是連接效率不高，有許多DNA分子無轉化能力，而且重組后的DNA分子比原載體DNA分子大，轉化困難。②轉導，病毒類侵染宿主菌的過程稱為轉導，一般轉導的效率比轉化高。

①直接篩選：有些載體帶有可辨認的遺傳標記，能有效地將重組分子與本底區分。例如：有些λ噬菌體攜帶外源基因后形成的噬菌斑就會從原來的混濁變為清亮；還有些載體分子攜帶外源基因后，形成的菌落或噬菌斑的顏色有明顯變化，如藍色變為無色；有些λ噬菌體能侵染甲菌而不能侵染乙菌，攜帶外源DNA片段后便能侵染乙菌，因此乙菌釋放的噬菌體均為重組分子。

②間接篩選：有引起載體分子帶有一個或多個抗藥性標記基因，當外源DNA插入到抗藥基因區后，基因失活，抗性消失。如一質粒有A和B兩個抗藥性基因，當外源基因插入到B基因區后，便只抗A葯而不抗B葯。因此能在A葯培養基上正常生長而不能在B葯培養上生長的便是重組分子。

③核酸雜交：廣泛用於篩選含有特異DNA順序的克隆。方法是將菌落或噬菌斑“印跡”到硝酸纖維膜等支持物上，變性后固定在原位，然後與標記的核酸探針進行雜交。陽性點的位置就是所需要的克隆。

④免疫學方法：如果重組克隆能在宿主菌中表達，就可以用特異的蛋白質抗體為探針，進行原位雜交，選擇特異的克隆。

分子克隆技術是70年代才發展起來的，它的出現和應用開闢了分子遺傳學研究的新領域，打開了人類了解、識別、分離和改造基因，創造新物種的大門。它的成就對於工業、農牧業和醫學產生深遠影響，並將為解決世界面臨的能源、食品和環保三大危機開拓一條新的出路。

利用分子克隆技術已將胰島素，人、牛和雞的生長激素、人的干擾素、鬆弛素、促紅細胞生長激素、乙型肝炎病毒抗原和口蹄疫病毒抗原的基因製成工程菌，利用發酵工業進行了大規模生產。還可提高微生物本身所產生的蛋白酶類和抗生素類藥物的產量。

通過遺傳工程看到癌細胞具有逆轉為正常細胞的可能性，例如SV40病毒引起的小鼠腫瘤細胞，在溫度高時可逆轉為正常細胞。為治療半乳糖血症，用帶有大腸桿菌乳糖操縱子的λ噬菌體去感染半乳糖血症患者的離體培養細胞，發現這種細胞的半乳糖苷酶達到了正常水平，並確實能代謝半乳糖。

以分子克隆技術為主體的基因工程、細胞工程、酶工程和發酵工程，四者緊密聯繫、常綜合利用。許多化學試劑如丙烯酸、己二酸、乙二醇、甲醇、環氧乙烷、烏頭酸和水楊酸等都可能利用分子克隆技術得到產品。在環境保護方面，人們根據需要進行基因操作，將某種微生物的基因轉入另一微生物，創造一些對有害物質降解能力更強的新菌種，以分解工業污水中的有毒物質。在食品工業方面，細菌可為人類生產有價值的蛋白質、氨基酸和糖等。

植物遺傳工程對提高農作物的產量、培育新的農作物品種提供了可能。有許多外源基因導入植物獲得成功。