蛋白質酪氨酸磷酸酶

中文名稱：蛋白質酪氨酸磷酸酶

英文名稱：protein tyrosine phosphatase;PTP

其他名稱：磷酸酪氨酸磷酸酶(phosphotyrosine phosphatase)

定義1：編號：EC 3.1.3.48。

應用學科：生物化學與分子生物學（一級學科）；酶（二級學科）

定義2：特異地水解蛋白質底物上的酪氨酸磷酸酯鍵，脫去磷酸，從而調節該蛋白質功能的酶。

應用學科：細胞生物學（一級學科）；細胞化學（二級學科）

瘦素增敏劑——蛋白酪氨酸磷酸酶　1B（PTP1B）抑製劑瘦素受體信號轉導的主要途徑是JAK-STAT途徑。瘦素受體本身無酪氨酸激酶活性，但可與JAK酪氨酸激酶偶聯。PTP1B可使瘦素受體相關激酶JAK2去磷酸化失活，導致瘦素受體不能對瘦素產生應答，從而引起瘦素抵抗。研究PTP1B特異性抑製劑以增敏瘦素的作用，成為近年來減肥藥研製領域的熱點。據報道，Vanadate是一種非特異性PTP1B抑製劑，而Formylchromone對PTP1B則有強效抑制作用（EC50為73微摩爾/升）。有研究者對其衍生物進行了篩選，其中得到活性最強的化合物抑制PTP1B的EC50為4.3微摩爾/升。

專利類型：發明

專利號：99806015

專利申請日：1999/03/12

公開（公告）號：

公開（公告）日：2001/06/20

分類號：A61K 31/17;A61K 31/38;A61K 31/395;A61K 31/44;A61K 31/50;A61K 31/505;C07C235/84;C07D209/18;C07D213/55;C07D239/28;C07D241/24;C07D333/62;C07D497/04;C07D513/04

申請（專利權）人：諾沃挪第克公司；昂托根公司

發明（設計）人：盧茨.S.里克特；亨里克.S.安德森；約瑟夫。瓦格納；克勞斯.B.傑普森;尼爾斯.P.H.莫勒；斯文。布蘭納；朗.傑普森；奧利.H.奧爾森；拉斯.F.艾弗森；丹尼爾.D.霍爾斯沃思；弗蘭克.U.阿克斯；紀雨；托德.K.瓊斯；威廉.C.里普卡；羅伊.T.烏耶達；蘇京；法里德。巴克爾；盧克.M.賈奇

申請人：諾沃挪第克公司；昂托根公司

國別省市：DK[丹麥]

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生物通報道：PIAS1通過SUMO化(sumoylation）下調蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP-1B）的活性。生物通 www.ebiotrade.com

蛋白酪氨酸磷酸酶-1B(protein tyrosine phosphatase 1B,PTP-1B）負向調節胰島素和瘦素（leptin）的信號轉導。PTB1B能夠發生磷酸化、氧化和蛋白質水解。最新一期《Nature Cell Biology》一篇文章中，Jonathan Chernoff等描述了一種調節PTB1B的新機制。Chernoff等發現小分子泛素樣修飾體(small ubiquitin-like modifier，SUMO）E3連接酶PIAS(STAT1的活性抑製劑）能夠與PTP1B相互作用，降低PTP1B的催化活性，高度強調sumoylation在調節磷酸酶活性和胰島素信號轉導途徑中的新作用。

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研究人員利用酵母雙雜交發現PIAS與PTP1B相互作用，在多個位點促進內源性PTP1B進行sumoylation；PTP1B在PIAS1被敲除的小鼠胚胎纖維原細胞中不進行sumoylation，說明PIAS是sumoylation所必需的。

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奇怪的是，PTP1B的sumoylation依賴於其細胞定位：內源性網狀組織/核膜－錨定的PTP1B突變體比質膜、細胞質或者核PTP1B突變體，發生sumoylation的程度要高。而且，PTP1B-GFP與MRFP-SUMO在核周區進行Förster熒光共振能量轉移（ resonance energy transfer，FRET)，說明大多數PTP1B的sumoylation發生在此區域。

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用精胺酸雙替換335和347位點的賴氨酸后，PTB1B的sumoylatio明顯降低，說明這這兩個位點是修飾的主要位點但絕非唯一位點。只有所有的四個被認可的sumoylation位點全部發生突變，才能得到不進行sumoylation的PTP1B。

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Chernoff與同事檢測sumoylation對PTP1B活性的影響，發現野生型PTP1B發生sumoylation后，抵抗p-nitrophenyl磷酸鹽和被磷酸化的胰島素受體β亞基的活性明顯下降，但是sumoylation抗性的突變體卻不受影響。重要的是，胰島素信號途徑通過一種PIAS1依賴的方式誘導PTP1B的sumoylation，短暫地抑制PTP1B下調胰島素受體活性的能力。這些發現提示，PIAS1-催化的PTP1B的sumoylation的物理相關性，展示了一種胰島素信號途徑的新的調節機制。SUMO修飾的PTP1B活性下降的精確的分子機制仍有待進一步研究。研究人員推測，sumoylation會引起構象改變，降低磷酸酶與底物相互作用的能力。

人蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)酶聯免疫分析試劑盒說明書

酪氨酸磷酸酶本試劑盒用於測定人血清，血漿及相關液體樣本中蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)的含量。

實驗原理：

本試劑盒應用雙抗原夾心法測定標本中人蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)水平。用純化的人蛋白酪氨酸磷酸酶抗原包被微孔板，製成固相抗原，往包被抗原的微孔中依次加入蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)，再與HRP標記的蛋白酪氨酸磷酸酶抗原結合，形成抗原-抗體-酶標抗原複合物，經過徹底洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉化成藍色，並在酸的作用下轉化成最終的黃色。顏色的深淺和樣品中的蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)呈正相關。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中人蛋白酪氨酸磷酸酶抗體(IA-2A)濃度。

酪氨酸磷酸酶試劑盒組成：

試劑盒組成 48孔配置 96孔配置 保存

說明書 1份 1份

封板膜 2片（48） 2片（96）

密封袋 1個 1個

酶標包被板 1×48 1×96 2-8℃保存

標準品：3600U/L 0.5ml×1瓶 0.5ml×1瓶 2-8℃保存

標準品稀釋液 1.5ml×1瓶 1.5ml×1瓶 2-8℃保存

酶標試劑 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

樣品稀釋液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

顯色劑A液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

顯色劑B液 3 ml×1瓶 6 ml×1瓶 2-8℃保存

終止液 3ml×1瓶 6ml×1瓶 2-8℃保存

濃縮洗滌液（20ml×20倍）×1瓶（20ml×30倍）×1瓶 2-8℃保存

酪氨酸磷酸酶樣本處理及要求：

1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現沉澱，應再次離心。

2. 血漿：應根據標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合10-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應該再次離心。

3. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

4. 細胞培養上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。檢測細胞內的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到100萬/ml左右。通過反覆凍融，以使細胞破壞並放出細胞內成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉澱形成，應再次離心。

5. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存備用。標本融化后仍然保持2-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其餘冷凍備用。

6. 標本採集后儘早進行提取，提取按相關文獻進行，提取后應儘快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放於-20℃保存，但應避免反覆凍融.

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

酪氨酸磷酸酶操作步驟

1. 標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設標準品孔10孔，在第一、第二孔中分別加標準品100μl，然後在第一、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然後從第一孔、第二孔中各取100μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然後在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為2400U/L ，1600U/L，800U/L，400U/L，200U/L）。

2. 加樣：分別設空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其餘各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然後再加待測樣品10μl（樣品最終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加於酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。

3. 溫育：用封板膜封板後置37℃溫育30分鐘。

4. 配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋後備用。

5. 洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重複5次，拍干。

6. 加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。

7. 溫育：操作同3。

8. 洗滌：操作同5。

9. 顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15分鐘.

10. 終止：每孔加終止液50μl，終止反應（此時藍色立轉黃色）。

11. 測定：以空白空調零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。測定應在加終止液后15分鐘以內進行。

酪氨酸磷酸酶注意事項：

1． 試劑盒從冷藏環境中取出應在室溫平衡15-30分鐘後方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應裝入密封袋中保存。

2． 濃洗滌液可能會有結晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結果。

3． 各步加樣均應使用加樣器，並經常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間最好控制在5分鐘內，如標本數量多，推薦使用排槍加樣。

4． 請每次測定的同時做標準曲線，最好做復孔。如標本中待測物質含量過高（樣本OD值大於標準品孔第一孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數（n倍）后再測定，計算時請最後乘以總稀釋倍數（×n×5）。

5． 封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6． 底物請避光保存。

7． 嚴格按照說明書的操作進行，試驗結果判定必須以酶標儀讀數為準.8． 所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應按傳染物處理。

9． 本試劑不同批號組分不得混用。

10. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，

在坐標紙上繪出標準曲線，根據樣品的OD

值由標準曲線查出相應的濃度；再乘以稀釋

倍數；或用標準物的濃度與OD值計算出標

准曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋

倍數，即為樣品的實際濃度。

試劑盒性能：

1.樣品線性回歸與預期濃度相關係數R值為0.95以上。

2.批內與批見應分別小於9%和11%

保存條件及有效期：

1.試劑盒保存：；2-8℃。

2．有效期：6個月