pc12

培養液：Ham's F12K（含2 mM L-谷氨醯胺，1.5g/L NaHCO3）+15%馬血清+2.5%胎牛血清。（也可用10%的馬血清和5%的小牛血清）

傳代：吸去培養液。加入新的培養液，用吸管吹下細胞或用手拍打培養瓶或刮下細胞到培養液中，用移液器把細胞吹散。加適量的細胞到新的培養器皿中。（以1：4為宜，傳代期間2-3天更換培養液）

凍存：95%培養液+5%DMSO凍存於液氮。

PC12細胞來源大鼠腎上腺髓質嗜鉻細胞瘤,廣泛用於神經系統疾病的體外研究。

PC細胞培養和向神經元誘導分化

pc12細胞是從大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤克隆的細胞株，主要分泌產物為兒茶酚胺類遞質包括多巴胺、去甲腎上腺素等。膜上有NGF受體，受生理水平NGF誘導后，它們停止分裂，長出神經突起，分化為具有交感神經元特性的細胞，常被用於分析神經元分化和NGF作用分子機制的研究，也被用於研究生長因子調節神經細胞基因表達改變的機制。

（一）材料和方法

1，pc12細胞的復甦和培養

從液氮罐中取出盛有pc12細胞的塑料螺口小瓶，立即投入37℃溫水中，並不時搖動令其儘快融化，然後從37℃水浴中取出塑料螺口小瓶，用酒精消毒後用吸管吸出細胞懸浮液，注入離心管並加入10倍培養液，混合后離心（一千轉每分鐘，五分鐘）除去上清液，再重複用培養液洗一次。然後用培養液稀釋成1x十的四次方個每毫升密度的細胞懸液，接種於75平方厘米塑料培養瓶中，每皿十毫升，置於37度含百分之十二氧化碳的培養箱內進行培養。培養液由百分之九十的DMEM、百分之五胎牛血清、百分之五馬血清、0.01%谷氨醯胺組成。

2，pc12細胞的擴增

pc12細胞培養5~10天，經0.25胰蛋白酶消化（37度，五分鐘）傳代，以1x十的四次方個每毫升密度接種於75平方厘米塑料培養瓶中進行擴增培養。

3，體外誘導pc12細胞向交感神經元樣細胞分化

取傳五代以上pc12細胞，經消化分散后，製成5x十的五次方每毫升密度的細胞懸液，接種於塗有小牛皮膠的35mm塑料培養皿中，每皿2ml，置於36度，10%co2的培養箱內進行培養。培養液由90%DMEM，5%馬血清、NGF20ng每毫升和谷氨醯胺0.10g/L組成。每周換液兩次，每次更換一半新鮮培養液。

（二）結果

1，pc12細胞的生長發育和形態學特徵

pc12細胞種植后8小時，生長良好的pc12細胞開始分裂增殖並凝聚成團生長，pc12細胞呈圓形，胞體周圍有暈光。培養5~10天後，分裂增殖的pc12細胞已形成密集的細胞簇，布滿整個培養瓶。

2，體外誘導pc12細胞向交感神經元樣細胞分化

分散的pc12細胞在含NGF的培養條件培養3天後，pc12細胞開始停止分裂。並逐漸分化為具有交感神經元特徵的細胞，開始長出神經突起，培養5天後，大多數pc12細胞轉變為類似於交感神經元的形態，突起逐漸增多並延長，形成稀疏的網路。隨著培養時間的延長，交感神經元樣細胞的胞體逐漸增大，胞體主幹和分支逐漸延長並增粗，經NSE免疫組織化學染色呈陽性反應。

一、對稱性PC12細胞分裂

培養PC12細胞二裂類分裂出現較晚，卻是更常見的PC12細胞直接分裂方式，二裂類PC12細胞分裂以橫裂為主，有對稱性和非對稱性之別。演化較晚期神經細胞的分裂過程又分核分裂和細胞分裂兩個階段。

1、對稱性PC12細胞核橫裂

PC12細胞核橫裂以橫縊型核橫裂為主。最早的橫縊型核橫裂見於裸核細胞和寡質細胞，只可見環形核縊痕，因時程太短，其他分裂細節不易觀察。分化的神經細胞核橫裂初期見細胞核赤道部出現環形淺凹痕，繼之凹痕逐步加深，而後將要分開的兩個子細胞核僅留部分核質相連，接著相連的核質減少，連接部逐漸變細（，繼之僅留極細的核質細絲相連，最後細絲斷開，形成兩個細胞核。

2、對稱性PC12細胞（質）分裂

細胞質分裂之初，有較多細胞質相連，隨著兩細胞距離變遠連接部逐漸變細。當兩細胞遠離時連接部可變得細長，以致成為胞質細絲，可見兩神經細胞之間的胞質細絲除單向或雙向神經突起接觸外，確實有細胞質問橋存在。細胞質間橋細絲繼續拉長可致斷裂，形成類似突觸樣連接，但遠不及相向兩突起的突觸連接複雜。

二、非對稱性PC12細胞分裂

在PC12細胞演化進程中，除對稱性二裂類細胞分裂外，也常見PC12細胞的非對稱性分裂，主要是演化程度不對稱和運動狀態不對稱。

（一）演化程度不對稱性PC12細胞分裂

演化程度不對稱性PC12細胞分裂是指分裂的兩個細胞演化程度有明顯差別，細胞的演化程度主要依據細胞核的演化程度判定。

1、細胞核演化進程細胞核也有其演化進程，識別標準是細胞核的嗜色性。隨著演化進展，細胞核嗜鹼性逐漸減弱，嗜酸性逐漸增強。在吉姆薩染色標本上可明顯區分細胞核嗜色性差異，幼稚細胞核強嗜鹼性，深藍色；演化晚期細胞嗜鹼性減弱，或顯示嗜酸性，呈紅色。用甲綠一哌若寧染色的PC12細胞鋪片，也可觀察到培養PC12細胞核的嗜色性演變。幼稚的PC12細胞核呈深綠色，少量細胞質呈淡紅色，隨著細胞演化齡增加，細胞核變成灰藍色，並逐漸淡染，細胞質增加，哌若寧著色明顯。

2、細胞分裂進程演化程度不對稱性PC12細胞分裂表現為綠色細胞核與灰色細胞核的分裂。在吉姆薩染色標本上，早期可見細胞核分成紅藍兩部分，而後分成兩個明顯不同的細胞核。其細胞質嗜色性也有明顯差異，即成為兩個演化程度不同的細胞。兩個細胞核距離漸遠，細胞質連接部分由多變少，以至僅留胞質細絲相連，最終完全斷離，成為兩個獨立的、演化程度不同的細胞。演化程度不對稱性細胞分裂是細胞分化的重要細胞學機制。

（二）PC12細胞動態不對稱性細胞分裂

不少PC12細胞分裂伴隨細胞突起生長。隨著細胞突起長長，進入突起內的細胞核離開母細胞核，突起內的細胞核離開母細胞核漸行漸遠，顯然在此分裂過程中，移動的主要是突起內細胞核，而母細胞核很少移動或相對靜止。突起內細胞核可以是循前導突方向移動，當前導突特別細長，從母體離開的細胞核就好像是流星錘被擲出去一樣，相當於錘鏈的兩細胞之間的細胞間橋可以達數百微米長。這和其他分裂方式一樣，在細胞分裂的一定階段，兩個子細胞之間確實有細胞間橋的存在。這種細胞間橋過細，則可以斷裂。大多分離出去的細胞核有完全生存能力，少數可能比母核小得多，生存能力可疑，甚或失去細胞核的形態，不能成為完整的細胞。