RACE

近年來隨著生物技術的不斷發展，出現了許多獲得新基因的方法和手段，如圖譜技術、轉座子標籤技術、mRNA差異顯示技術、二減法技術以及cDNA文庫篩選技術等。但上述方法大多具有實驗周期長、技術步驟繁瑣且工作量大等特點。cDNA末端快速擴增技術(rapid amplification of cDNA ends, RACE)是一種基於PCR從低丰度的轉錄本中快速擴增cDNA的5'和3’末端的有效方法，以其簡單、快速、廉價等優勢而受到越來越多的重視。

經典的RACE技術是由Frohman等(1988)發明的一項技術，主要通過RT-PCR技術由已知部分cDNA序列來得到完整的cDNA5’和3’端，包括單邊PCR和錨定PCR。該技術提出以來經過不斷發展和完善，克服了早期技術步驟多、時間長、特異性差的缺點(Frohman等,1995:Schaefer,l995: Chen,1998: Bespalova等,1998: Matz等1999)。對傳統RACE技術的改進主要是引物設計及RT-PCR技術的改進：改進之一是利用鎖定引物((lock docking primer)合成第一鏈cDNA,即在oligo(dT)引物的3'端引入兩個簡併的核苷酸【5'-Oligo(dT)16_30MN-3', M=A/G/C;N=A/G/C/T】，使引物定位在poly(A)尾的起始點，從而消除了在合成第一條cDNA鏈時oligo(dT)與poly(A)尾的任何部位的結合所帶來的影響；改進之二是在5‘端加尾時，採用poly(C)，而不是poly(A);改進之三是採用RNase H一莫洛尼氏鼠白血。病毒(MMLV)反轉錄酶或選擇嗜熱DNA聚合酶可能在高溫h (60 度-70度)有效地逆轉錄mRNA，從而消除了5’端由於高GC含量導致的mRNA 二級結構對逆轉錄的影響；改進之四是採用熱啟動PCR (hot start PCR)技術和降落PCR(touch down PCR)提高PCR反應的特異性。

隨著RACE技術日益完善，目前已有商業化的RACE技術產品和試劑盒推出，如CLONTECH的MarathoTM技術和SMART TM RACE技術。邢桂春等(2001)先後使用上述兩種盒進行RACE反應，結果發現使用Marathon TM所得到的片斷總是比採用SMARTsup]TMRACE盒到所得到的片斷短。其原因在於Marathon TM技術反轉錄反應往往不能真正達到mRNA的5’末端。所以認為，進行RACE反應應當優選SMARTTM RACE盒。以下就國內目前應用最廣的SMART TM RACE盒為例，簡要概述RACE技術的原理和操作過程。 SMARTTM 3‘-RACE的原理是：利用mRNA的3‘末端的poly(A)尾巴作為一個引物結合位點，以連有SMART寡核苷酸序列通用接頭引物的Oligo(dT)30MN作為鎖定引物反轉錄合成標準第一鏈cDNA。然後用一個基因特異引物GSP1(gene specific primer,GSP)作為上游引物，用一個含有部分接頭序列的通用引物UPM(universal primer,UPM)作為下游引物，以cDNA第一鏈為模板，進行PCR循環，把目的基因3‘末端的DNA片段擴增出來。

與篩庫法相比較：

1）此方法是通過PCR技術實現的，無須建立cDNA文庫，可以在很短的時間內獲得有利用價值的信息。

2）節約了實驗所花費的經費和時間。

3）只要引物設計正確，在初級產物的基礎上可以獲得大量的感興趣基因的全長。

實驗室現有的RACE試劑盒的簡介

™RACE是一種從一個相同的cDNA模板進行5‘和3‘末端快速克隆的方法。此方法會產生較少的錯誤條帶。此過程中使用的酶混合物非常適合長鏈PCR。

™使用此方法的要求是必須知道至少23－28個核苷酸序列信息，以此來設計5’末端和3‘末端RACE反應的基因特異性引物（GSPs）。

引物的設計：

基因特異性引物（GSPs）應該是：

™23－28nt

™50－70%GC

™Tm值≥65度，Tm值≥70度可以獲得好的結果

需要實驗者根據已有的基因序列設計5‘和3‘RACE反應的基因特異性引物（GSP1和GSP2).由於兩個引物的存在，PCR的產物是特異性的。

反應中涉及到的一些事項

™cDNA的合成起始於polyA+RNA。如果使用其它的基因組DNA或總RNA，背景會很高。

™RACE PCR的效率還取決於總的mRNA中目的mRNA的量和不同的引物有不同的退火和延伸溫度。

™在進行5‘和3’RACE PCR的時候應該使用熱啟動。

™表4中給出了所有引物的相互關係。重疊引物的設計會對全長的產生有幫助。另外，重疊的引物可以為PCR反應提供一個對照。並不是絕對的要利用設計的引物產生重疊片段。

™引物GSP中的GC含量要在50－70%之間。這樣可以使用降落PCR。避免使用自身互補性的引物序列，否則會產生回折和形成分子內氫鍵。另外，避免使用與AP1互補的引物，尤其是在3‘末端。

如果要用重疊片段來檢測設計的引物，GSp1和GSp2之間至少是100－200鹼基。只有這樣才可以用擴增的產物來鑒定設計的引物是否正確。

™降落PCR可以明顯的增加RACE PCR產物的特異性。在最開始的循環中，退火溫度高於AP1引物的Tm值，可以增加對特異性條帶的擴增。隨後的退火和延伸的溫度降回到AP1的溫度，可以進行隨後的PCR循環。

™驗證基因特異性引物的對照：

\單個引物的陰性對照：只用一個引物GSP來進行陰性對照。這樣不應該產生任何的條帶。如果可以看到明顯的產物，應該改變循環的參數，或重新設計原始引物。

\利用兩個GSPS進行陽性對照：（只有兩個GSP可以產生重疊的時候才可以採用此步。）為了確定RNA樣品中目的基因確實表達，利用兩個GSP和接頭連接的cDNA來產生陽性對照。可以產生兩個引物之間的重疊大小的片段。如果沒有這個片段，應該重複cDNA的合成，或者從一個不同的組織或細胞來源進行cDNA的合成。

™製備和抽提polyA+RNA

不要使用DEPC處理過的水。

純化完mRNA之後，利用瓊脂糖凝膠電泳檢測mRNA的質量。哺乳動物的mRNA樣品是0.5－12kb的拖帶，在其中有4.5和1.9kb的rRNA的條帶。非哺乳動物的mRNA應略小

①cDNA第一條鏈的合成：

ƒ我們建議進行cDNA合成的對照反應，這樣可以對樣品的cDNA的合成進行鑒定。加入各種試劑之後，在水浴中42度保溫一個小時。

注意：在水浴或酒精浴中保溫會減少反應體積，從而降低第一鏈的合成效率。

將管放於冰上，以終止第一鏈的合成反應。

直接進行第二鏈的合成。

②cDNA第二鏈的合成：

第二鏈合成的酶混合物中，含有聚合酶、RNaseH和連接酶。T4 DNA聚合酶的功能是補平dscDNA的末端。我們建議做陽性對照，試劑盒中提供人類骨骼肌的mRNA。

ƒ建議進行陽性對照,cDNA的質量取決於製備的polyA+RNA的質量。非哺乳動物樣品的mRNA大約在0.5－3kb之間。

ƒ通過電泳檢測cDNA的產量，與對照進行對比，這樣可以有利於在以後的步驟中對cDNA進行稀釋。

接頭的連接及連接產物的稀釋

ƒ按照程序進行連接反應。

ƒ如果沒有對比樣品和對照的產量，利用Tricine－EDTA buffer製備接頭連接的dscDNA的1/50和1/250的稀釋物，用兩種稀釋物進行以下的RACE PCR反應，直到鑒定出哪一種稀釋可以得到好的效果。

RACE－PCR擴增

·進行5’和3’的RACE－PCR擴增。

·利用以下的程序進行降落PCR反應：

94度30秒

5個循環：94度5秒

72度4分鐘

5個循環：94度5秒

70度4分鐘

20－25個循環：94度5秒

68度4分鐘

注意：

我們建議使用降落PCR反應，這就要求GSP的Tm值≥70度。

當循環結束時，利用1.2%瓊脂糖凝膠電泳分析每一個管中的產物5μl，使用適當的分子量marker。

·可以根據你的基因的特異性來設計最理想的循環參數。如果看不到帶或者只有微弱的帶，在68度多加5個循環。最佳的延伸時間取決於擴增條帶的長度。如果片斷的長度在2－5kb的時候，經常使用4min，0.2-2kb的時候將延伸時間減到2－3min，對於5－10kb的條帶，延伸時間增加到10min。

③RACE產物的驗證：

{應該對RACE的片段進行驗證，以此來確定是否已經擴增了理想的產物。如果得到的是多條帶或者研究的是多基因家族的成員，驗證是非常有用的。

有3種驗證RACE產物的方法：

（1）比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。

（2）Southern blot

（3）克隆並測序

{我們建議最好測得RACE產物的部分序列。有的時候需要嵌套引物的存在。

比較由GSP和NGSP獲得RACE產物。

{對於5‘末端的RACE產物，比較由AP1和GSP1擴增出來的產物和由AP1和NGSP1擴增出來的產物。

{對於3‘末端的RACE產物，比較由AP1和GSP2擴增出來的產物和由AP1和NGSP2擴增出來的產物。這對於鑒定多條帶是否是上一個PCR的特異性產物是非常有用的。

{如果條帶是正確的，在嵌套PCR反應中的條帶應該是略微小一些。基本PCR和嵌套PCR產物的遷移率的不同取決於cDNA結構中GSP1和嵌套引物的位置。

④RACE產物的克隆和測序：

{電泳5μl回收的樣品來鑒定回收的質量。

{將回收的PCR產物直接克隆到/A型的PCR克隆載體中。另外還可以利用接頭和/或cDNA合成引物中的Not1、Srf1、Xma1、ECOR1等酶切位點，將產物克隆到常規載體中

對於5‘端的RACE產物，我們建議挑取至少8－10個不同的克隆以獲得5‘端的最大可能性的序列。（反轉錄並不總是進行到mRNA模板的5’末端，尤其是長模板。另外，T4 DNA聚合酶會移走5‘末端的0－20個鹼基。）

{一旦鑒定了含有插入片斷的克隆，應該獲得多的序列信息。理想的是，可以對整個開放讀碼框進行測序。包括5‘和3‘的非翻譯區。

全長cDNA的獲得

{通過部分或全部測序鑒定了RACE產物后，可以通過兩種選擇獲得全長的cDNA。

通過PCR的方法。

通過克隆的方法。

通過PCR的方法獲得全長cDNA：

„擴增長的cDNA需要較長的延伸時間，但是如果延伸的時間過長，可以產生拖帶，所以要慎重的設計引物。

„根據從5‘和3‘RACE產物獲得序列信息設計5’和3‘GSP引物。這些引物應該來自cDNA的3’或者5‘的末端，應該是23－28nt長。不應該在引物的末端加上限制性位點，這樣會導致高背景。在某些時候可以設計3’和5‘的嵌套引物。但是還是應該先利用一對引物進行PCR反應。

通過PCR的方法獲得全長cDNA：

„進行如下的熱循環：

94度30秒

25個循環94度5秒

72度2－15分鐘

„延伸的時間應該等於預期的cDNA長度加上2分鐘。例如：預期得到6kb的條帶，用6+2=8分鐘的延伸時間。

„注意：如果沒有條帶或者條帶弱，增加5個循環；或者優化PCR的條件。

通過PCR的方法獲得全長cDNA：

„在1.2%的瓊脂糖凝膠上分析5μl的樣品。通常情況下，可以見到一條單一帶，如果這樣，利用膠來純化全長的cDNA。

„製備1.2%的TAE buffer製備瓊脂糖凝膠。不使用TBE buffer，TBE的膠很難製備全長的cDNA。

„將剩下的45μl反應物點樣，選用適當的marker。

„利用長波紫外觀察cDNA（≧300nm）切下全長的cDNA。注意：應該盡量減少紫外對cDNA的照射。

通過PCR的方法獲得全長cDNA：

„利用膠回收試劑盒回收cDNA。此試劑盒適合回收2.5kb以下的RACE產物；對於長的片段，可以通過電洗脫獲得好的結果。如果你選擇使用其他的純化方法，最後用Tricine－EDTA buffer 30μl重新懸浮DNA樣品。

„將全長的cDNA克隆到T/A型的PCR克隆載體中。

通過克隆產生全長的cDNA：

z如果你已經獲得了含有重疊部分的5‘和3’RACE產物，同時在cDNA的重疊部分含有一個酶切位點的話，通過克隆技術可以獲得全長的cDNA。

z利用酶切獲得的3‘和5’擴增產物，並且利用T4DNA連接酶將它們連接起來。利用接頭和cDNA合成引物中的內切酶將最終的全長cDNA克隆到載體中。

z在哺乳動物基因組中，NOT1和Srf1酶切非常稀少，大約106bp才出現一次，因此在絕大多數的cDNA中是不出現的。

Appendix：cDNA接頭和引物z接頭在設計的時候可以使cDNA的擴增成功進行：z接頭的5‘端在第一個循環中沒有AP1引物的結合位點。AP1的結合位點只有通過GSP的擴增之後才能夠產生。z這些特點中的每一個都可幫助減少cDNA片段擴增過程中出現的非特異性擴增。另外，它們允許從一個複雜的DNA片段的混合物中擴增出靶樣品――所有的產物都有相同的末端結構，因為使用了單一的一套GSPs。

RACE (企業實體與環境調查)

這是在實施審計程序時必要的一個程序。