變性凝膠電泳

原理

雙鏈DNA分子在一般的聚丙烯醯胺凝膠電泳時，其遷移行為決定於其分子大小和電荷。不同長度的DNA片段能夠被區分開，但同樣長度的DNA片段在膠中的遷移行為一樣，因此不能被區分。DGGE/TGGE技術在一般的聚丙烯醯胺凝膠基礎上，加入了變性劑（尿素和甲醯胺）梯度，從而能夠把同樣長度但序列不同的DNA片段區分開來。一個特定的DNA片段有其特有的序列組成，其序列組成決定了其解鏈區域(meltingdomain,MD)和解鏈行為(meltingbehavior)。一個幾百個鹼基對的DNA片段一般有幾個解鏈區域，每個解鏈區域有一段連續的鹼基對組成。當變性劑濃度逐漸增加達到其最低的解鏈區域濃度時，該區域這一段連續的鹼基對發生解鏈。當濃度度再升高依次達到各其他解鏈區域濃度時，這些區域也依次發生解鏈。直到變性劑濃度達到最高的解鏈區域濃度后，最高的解鏈區域也發生解鏈，從而雙鏈DNA完全解鏈。

不同的雙鏈DNA片段因為其序列組成不一樣，所以其解鏈區域及各解鏈區域的解鏈濃度也是不一樣的。當它們進行DGGE時，一開始變性劑濃度比較小，不能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區域解鏈，此時DNA片段的遷移行為和在一般的聚丙烯醯胺凝膠中一樣。然而一旦DNA片段遷移到一特定位置，其變性劑濃度剛好能使雙鏈DNA片段最低的解鏈區域解鏈時，雙鏈DNA片段最低的解鏈區域立即發生解鏈。部分解鏈的DNA片段在膠中的遷移速率會急劇降低。因此，同樣長度但序列不同的DNA片段會在膠中不同位置處達到各自最低解鏈區域的解鏈濃度，因此它們會在膠中的不同位置處發生部分解鏈導致遷移速率大大下降，從而在膠中被區分開來。然而，一旦變性劑濃度達到DNA片段最高的解鏈區域溫度時，DNA片段會完全解鏈，成為單鏈DNA分子，此時它們又能在膠中繼續遷移。因此如果不同DNA片段的序列差異發生在最高的解鏈區域時，這些片段就不能被區分開來。在DNA片段的一端加入一段富含GC的DNA片段（GC夾子，一般30-50個鹼基對）可以解決這個問題。含有GC夾子的DNA片段最高的解鏈區域在GC夾子這一段序列處，它的解鏈濃度很高，可以防止DNA片段在DGGE膠中完全解鏈。當加了GC夾子后，DNA片段中基本上每個鹼基處的序列差異都能被區分開。