高解析度熔解

高解析度熔解

高解析度熔解(High-resolution melting,簡稱HRM)分析是一門新興的技術。HRM技術應用廣泛,操作簡單又經濟,結果精確且可靠,適合任何實驗室使用。

概述


高解析度熔解(High-resolution melting,簡稱HRM)分析是一門新興的技術。它僅僅通過PCR之後的熔解曲線分析,就能檢測PCR片段的微小序列差異,從而應用在突變掃描、序列配對和基因分型等多個方面。憑藉其速度和簡便性,高解析度熔解這種方法正在迅速普及。
其實雙鏈DNA的熔解分析可追溯到上世紀六十年代,當時是通過紫外吸收來監測的。分析需要幾微克的DNA,而樣品以0.1-1.0°C/分鐘的速率緩慢加熱,常常要花上幾個小時才能完成。後來,LightCycler定量PCR儀的出現,讓熒光熔解分析變得流行。樣品量因毛細管而縮減至納克級,且熔解速率更快,達0.1-1.0°C/秒,這樣熔解時間縮短至幾分鐘。當時使用的染料是SYBR® Green I。

染料


這種熔解分析只能區分在片段大小和GC含量上差別較顯著的DNA序列,比如檢查PCR擴增產物中是否存在引物二聚體及其他非特異性的擴增。如果要區分SNP,解析度還不夠。為什麼呢?這裡有必要先介紹一下飽和染料和非飽和染料。SYBR Green I就屬於非飽和性染料,由於它對PCR的抑制作用,在實驗中的使用濃度很低,遠未將DNA雙螺旋結構中的小溝飽和。這樣,DNA雙鏈高溫變性時,單鏈部分的熒光染料分子發生重排,熒光染料分子重新結合到雙鏈DNA的空置位點,造成熒光信號沒有變化,因此出現假陰性,特異性下降。
於是,飽和染料問世了。為什麼稱為飽和染料呢?因為它們即便在飽和濃度(熒光最大)下,也不會抑制PCR。故高濃度的染料飽和了DNA雙螺旋結構中的小溝,在DNA解鏈過程中就不會發生重排,這樣熔解曲線才有了更高的解析度。目前市場上的飽和染料主要有LC Green、LC Green Plus、SYTO 9等幾種。光有染料還不夠,儀器也要相應升級呢。
擴增子的熔解曲線完全取決於DNA鹼基序列。序列中如有一個鹼基發生了突變,都會改變DNA鏈的解鏈溫度。但是這個差異極小,只有零點幾攝氏度,如果儀器的解析度不高,是根本無法檢測的。

解析度


那麼什麼樣的解析度才是高解析度呢?根據儀器現有的功能測試,在熔解操作時每攝氏度至少要獲得10個數據點,這是對儀器的最低要求。此外,溫度均一性也同樣重要。如果兩孔之間溫度相差0.1°C,就很可能導致最終的熔解溫度相差0.1°C,這樣就無法保證HRM分析結果的準確性。大多數常規定量PCR儀的孔間溫度差在0.3-0.5°C,這也決定了它們無法勝任HRM。
目前市場上有多個廠家提供HRM分析的儀器,包括Idaho Technology、Corbett(Qiagen)、Roche等,有些是專供HRM的儀器,有些則是附帶HRM功能的定量PCR儀。HRM的發明者—美國猶他大學醫學院的Wittwer實驗室曾評估了市場上多台儀器在基因分型和突變掃描上的性能1。他們發現,對於大部分儀器的準確基因分型來說,主要限制在於平板上的空間溫度差異(Tm的標準偏差為0.020-0.264°C)。其它差異如數據密度、信噪比和熔解速率,也會影響雜合體的掃描。經過比較發現,空氣加熱型儀器以及樣品溫度單獨控制的儀器有著更低的Tm標準偏差(0.018-0.065),而加熱塊型儀器則在0.092-0.274。
在擁有飽和染料和高解析度儀器之後,HRM分析就可以開始啦。這個過程其實很簡單,就是對PCR的擴增子進行加熱,溫度從50°C逐漸上升到95°C。在此過程中,擴增子逐漸解鏈,在到達熔解溫度(Tm)時,DNA鏈完全分開。在HRM分析的初期,熒光強度很高,隨著溫度升高,雙鏈DNA逐漸減少,熒光強度也就下降了。HRM儀器通過照相機,記錄下熒光變化的整個過程。通過對數據的作圖,就生成了熔解曲線。
果然夠簡單吧,連探針也無需設計,只要在常規PCR中加一個飽和染料即可。HRM既可以對未知突變進行篩查、掃描,也可以對已知突變進行分析。相對於傳統的突變分析而言,操作步驟大大簡化,時間和成本也降低了不少。而且樣品經PCR擴增后直接進行HRM分析,無需轉移,真正實現了閉管操作,降低了污染的風險。
正是憑藉這些優勢,HRM近年來廣泛用於突變掃描、序列配對、基因分型和甲基化分析等應用中。

序列配對


序列差異分析常用的方法包括單鏈構象多態性、變性梯度凝膠電泳、變性高效液相色譜、測序等,這些方法都需要分離樣品,之後進行多步反應,操作繁瑣,耗時長,且PCR產物有污染的風險。而HMR在5分鐘之內就能完成,無需額外的步驟,也容易開發成高通量篩選,且是唯一的閉管操作,增加了分析的可靠性,這些優勢對於分子診斷分析而言,格外重要。
在器官移植中,醫生通常會檢測兄弟姐妹的HLA,以便了解主要組織相容性是否匹配。利用PCR產物的熔解曲線,能快速配對HLA序列。與熔解溫度(Tm)不同,那只是熔解曲線上的一個點,高解析度熔解是分析整個熔解曲線。利用熔解曲線的形狀作為指示劑,來顯示雜合DNA所形成的異源雙鏈的序列匹配。之後將兩個DNA按1:1的比例混合,重新熔解,並將新曲線與原先的曲線進行比較,來驗證序列的匹配。如果兩個樣品的序列不是完全相同的,那麼混合后異源雙鏈的熔解曲線形狀會改變。
瑞典烏普薩拉大學的Olof Gidlöf等曾開發出線粒體基因組中兩個超變區HVI和HVII的HRM分析,以分辨不同個體的DNA,作為法醫鑒定中測序前的預篩選2。研究結果表明,線粒體DNA中HVI和HVII所存在的序列變異確實產生了熔解曲線形狀的差異,能辨別不同個體的DNA,這樣就能排除不匹配的法醫材料,從而節省線粒體DNA測序的時間和費用。另外,與其它技術相比,HRM操作簡單,價格低,能同時篩選大量的樣本。

突變掃描


單鹼基改變、插入、缺失都能通過HRM來檢測。在靈敏度和特異性方面,高解析度熔解也高於dHPLC在內的傳統方法。當變異體為低等位基因片段時,它甚至比DNA測序還靈敏。測序只能檢測低至20%的變異體,而HRM能檢測的變異體低至2%。而且,測序所花的時間、費用和精力,與HRM是不可同日而語的。
對於400 bp以下的PCR產物,掃描單鹼基變化的靈敏度和特異性皆為100%。對於400到1000 bp的PCR產物,靈敏度為96.1%,特異性為99.4%。PCR產物中變異的位置不影響掃描準確性。儘管HRM是為檢測雜合體(一個等位基因發生突變)而設計的,但它也能檢測純合體(兩個等位基因都有突變)。對於半合子變異體(X連鎖或Y染色體),最好將未知樣品與已知野生型的樣品混合。
LMNA基因的突變會導致多種失調,現在稱之為核纖層蛋白綜合征。由於待研究的個體頗多,故必須用一種特別靈敏且特異的方法來進行突變掃描。於是,Gilles Millat等就開發出適合LMNA突變掃描的HRM分析3。他們同時用了HRM和dHPLC兩種方法,對64位患有擴張性心肌病的病人進行篩選。結果表明,凡是dHPLC或直接測序能檢測出的基因變異,HRM分析也能輕鬆鑒定,且速度比dHPLC快2倍,還更為經濟。研究人員認為,HRM分析是鑒定LMNA遺傳變異的高靈敏、高通量的廉價方法。

基因分型


傳統的基因分型方法不僅耗時費力,還需要購買價格不菲的探針。相比之下,HRM分析則是優勢多多,無需擴增和製備,排除了污染的風險;探針的錢也省了;還能檢測未知的變異體,這一點探針可無能為力。有了飽和染料,PCR產物全程被標記,因此所有的熔解區域都能檢測到。對於同一擴增子內的不同雜合體,通過曲線形狀的差異也能區分開。HRM大約能分辨93%的雜合體。大部分純合體也能通過熔解來分辨,但不是全部。大約有4%的人單鹼基變異體有著相同的Tm,且圖像對稱。在這種情況下,可以將已知的純合體與未知的純合體混合,再進行分析。
Lasse Kristensen等曾為參與甲基代謝的關鍵基因(MTHFR、MTR和DNMT3b)開發出HRM分析,對它們進行基因分型,並在Rotor-gene 6000等儀器上進行檢測4。他們認為,與基於Taqman探針的基因分型相比,HRM分析更經濟。無需使用探針,分析所需的優化也更少,成功率更高。與焦磷酸測序、SNP晶元等多種技術相比,HRM是最佳選擇。

甲基化分析


HRM分析還為DNA甲基化狀態的檢測另闢蹊徑。DNA樣品通過亞硫酸氫鹽的處理,將未甲基化的胞嘧啶轉化成尿嘧啶。這樣,原先未甲基化模板所產生的PCR產物比甲基化模板的Tm要低。HRM還能確定特定樣品中甲基化的比例。將不同比例的甲基化和未甲基化DNA混合,製作出標準曲線,將樣品的熔解曲線與之相比較,從而確定樣品中甲基化的比例。
異常的甲基化模式往往與癌症相關聯,於是Erci Smith等開發並驗證了快速定量DNA甲基化狀態的HRM分析5。他們利用數學方法來標準化加熱DNA所產生的原始熒光數據,從這些數據中計算出熔解開始和結束的溫度,從而反映模板分子的甲基化水平。之後,他們還用已知甲基化水平的寡核苷酸及DNA進行了驗證。他們發現,通過HRM分析這種快速單管的方法來定量甲基化是可靠的,引物容易設計,且無需專門的軟體。所獲得的參數提供了標本中甲基化的客觀描述和定量,能用於標本之間的統計學比較。
綜上,HRM技術應用廣泛,操作簡單又經濟,結果精確且可靠,適合任何實驗室使用。市場上有一些專供HRM分析的儀器,不過,那些帶有HRM功能的定量PCR儀則更實用。QIAGEN的Rotor-Gene Q(Corbett Rotor-Gene 6000)就是全球第一台將實時擴增與HRM分析技術相結合的實時熒光定量分析裝置。Rotor-Gene Q的溫度均一性為0.01°C,溫度解析度為0.02°C,解決了溫度均一性、精確性和解析度的問題,實現了定量擴增與HRM的合二為一。