DNA疫苗

許多畜禽病毒性傳染病，已不能依靠傳統疫苗如滅活疫苗、弱毒疫苗等對其進行防治，DNA疫苗的出現使得這一狀況得到改善。編碼病毒、細菌和寄生蟲等不同種類抗原基因的質粒DNA，能夠引起脊椎動物如哺乳類、鳥類和魚類等多個物種產生強烈而持久的免疫反應。DNA疫苗被稱為繼滅活疫苗和弱毒疫苗、亞單位疫苗之後的“第三代疫苗”，具有廣闊的發展前景。

DNA疫苗的研製是基因工程技術在疫苗研究中的另一重要突破。將一種抗原基因重組到真核表達載體，直接或經包裝注入體內表達出相應抗原，誘導機體產生免疫應答。這是極有發展潛力的一種新疫苗。

DNA疫苗又稱核酸疫苗或基因疫苗，是指將編碼某種蛋白質抗原的重組真核表達載體直接注射到動物體內，使外源基因在活體內表達，產生的抗原激活機體的免疫系統，從而誘導特異性的體液免疫和細胞免疫應答。

DNA疫苗可經一定途徑進入動物體內，被宿主細胞攝取後轉錄和翻譯表達出抗原蛋白，此抗原蛋白能刺激機體產生非特異性和特異性2種免疫應答反應，從而起到免疫保護作用。

DNA疫苗不同於傳統的疫苗，DNA疫苗旨在將病原微生物的某種專門組分的裸露DNA編碼直接注入機體內。儘管此類疫苗尚未面世，但其在技術上的飛速發展有可能開創免疫學的新紀元。目前正在研製的此類疫苗包括瘧疾、流感、輪狀病毒、HⅣ等。

該疫苗既具有減毒疫苗的優點。同時又無逆轉的危險，因此越來越受到人們的重視，被看作是繼傳統疫苗及基因工程亞單位疫苗之後的第三代疫苗。

DNA疫苗能誘導細胞免疫和體液免疫。

消除導入可能與"減毒"疫苗相關的強毒力病毒的危險性。

使用一次，即能產生長期免疫力，無須增加劑量，並可提高依從性。

多個病原體的基因可裝在同一個質粒上，減少了免疫時多次注射的不適。

DNA可以乾粉形式保存數年，且仍保持起活性。

DNA疫苗具有許多優點：

①DNA接種載體（如質粒）的結構簡單，提純質粒DNA的工藝簡便，因而生產成本較低，且適於大批量生產；

②DNA分子克隆比較容易，使得DNA疫苗能根據需要隨時進行更新；

③DNA分子很穩定，可製成DNA疫苗凍干苗，使用時在鹽溶液中可恢復原有活性，因而便於運輸和保存；

④比傳統疫苗安全，雖然DNA疫苗具有與弱毒疫苗相當的免疫原性，能激活細胞毒性T淋巴細胞而誘導細胞免疫，但由於DNA序列編碼的僅是單一的一段病毒基因，基本沒有毒性逆轉的可能，因此不存在減毒疫苗毒力回升的危險（Davis等，1999），而且由於機體免疫系統中DNA疫苗的抗原相關表位比較穩定，因此DNA疫苗也不象弱毒疫苗或亞單位疫苗那樣，會出現表位丟失（Donnelly等，1999）；

⑤質粒本身可作為佐劑，因此使用DNA疫苗不用加佐劑，既降低成本又方便使用（Babiuk等，1999）；

⑥將多種質粒DNA簡單混合，就可將生化特性類似的抗原（如來源於相同病原菌的不同菌株）或1種病原體的多種不同抗原結合在一起，組成多價疫苗，從而使1種DNA疫苗能夠誘導產生針對多個抗原表位的免疫保護作用，使DNA疫苗生產的靈活性大大增加。

直接肌肉注射

注射的DNA在肌肉細胞中以環型分子存在，不能複製，並不能整合到宿主細胞染色體中。肌肉細胞中特有的橫管系統與細胞外空間有直接交通，因而可能介導質粒 DNA的內吞作用。而且橫紋肌中溶酶體和DNA酶的含量較低，可能也是質粒DNA能在細胞中存在較長時間的原因。

微離子轟擊介導的DNA免疫

即基因槍。其技術依據是亞微粒的鎢和金能自發地吸附DNA，將包裹有金粉或鎢粉的 DNA 質粒，藉助高能電場以極快的速度轟擊動物表皮組織，能獲得滿意的免疫效果。

目前，DNA疫苗尚未得到廣泛的應用，除了因為它是一種新事物，不大為人所了解之外，它本身的安全問題則是人們對它 的最大顧慮。DNA疫苗存在的問題如下：

外源DNA進入機體后是否整合到宿主基因組，導致癌基因激活或抑癌基因失活。

疫苗DNA長期在體內表達是否會誘導機體產生免疫耐受，長遠來說，導致機體免疫功能低下。

疫苗DNA 作為一種外來物質，是否會引起機體產生抗DNA抗體。

DNA疫苗誘導的CTL反應是否會對其他細胞產生殺傷作用。

1偽狂犬病病毒（PRV) 將編碼PRVgC或gD基因的質粒DNA免疫豬，能誘導保護性抗體的生成和細胞免疫的產生；將編碼gB、gC、gD的多種質粒DNA混合使用，對引導免疫反應更有效

2豬流感病毒（HⅣ） Mackling等（1998）的試驗結果表明，編碼HⅣ1株的血凝素（HA）和核衣殼蛋白（NP）質粒DNA用金顆粒包裹，以基因槍轟擊豬的表皮進行免疫后，HA質粒DNA能使豬產生粘膜免疫反應而對流感病毒的攻擊具有抵抗力，DNA疫苗引起的免疫反應與滅活疫苗相當。

3 豬呼吸與繁殖綜合征病毒（PRRS) PRRS基因片段ORF5編碼的主要囊膜糖蛋白GP5是該病毒的3個主要結構蛋白之一。含有ORF5基因質粒DNA能誘導豬抗GP5特異性中和抗體的產生；且免疫豬的外周血單核細胞在GP5重組蛋白存在時能夠發生轉化反應，顯示了GP5特異性細胞免疫的產生（Pirzadeh B等，1998）。Meng（2000）將GP5基因克隆入巨細胞病毒（CMV）早期啟動子的控制之下構建成真核表達質粒而製備出DNA疫苗，用其免疫仔豬后可誘導抗體的產生，實驗室攻毒后顯示出良好的保護效果。

4口蹄疫病毒（FMDV) 將FMDV全長基因組的cDNA克隆到質粒，並去除其編碼核衣殼蛋白VP1的細胞結合部位的DNA序列，構建成質粒DNA以肌肉或皮內注射，初次免疫后2～4周，可使所有的豬都產生特異的病毒中和抗體，攻毒試驗中呈現部分保護作用

5豬瘟病毒（CSFV) 餘興龍等（2000）構建了CSFV主要保護性抗原E2基因4種不同的真核表達質粒。小鼠免疫試驗結果表明，E2基因上不同的功能區對基因疫苗的免疫應答有很大影響，有信號肽序列的E2基因可誘導特異性的免疫反應，且無跨膜區序列的E2基因所誘導的免疫應答反應比有跨膜區序列的強，而無信號肽序列的E2基因所誘導的免疫應答反應比有跨膜區序列的強，而無信號肽序列的E2基因則不能誘導產生CFSV特異性的免疫反應。攻毒保護試驗結果表明，免疫家兔最少可抵抗10個最小感染劑量（MID）的豬瘟兔化弱毒苗（HCⅣ）的攻擊；免疫豬可抵抗致死劑量的CFSV石門株強毒的攻擊。

6牛呼吸道合胞體病毒（BRSV) 用BRSV G基因構建的DNA疫苗，以無針方式免疫小牛時比皮內或肌肉注射引起的免疫反應強烈。

牛皰疹病毒（BHV) 用表達BHV?1 gD基因的質粒DNA疫苗免疫牛，能產生很高的中和抗體；攻毒試驗后發現，免疫組比非免疫組的病毒排放量明顯減少（schrijver R S等，1997）。此疫苗通過肌肉或皮內注射均可引導免疫反應的產生。但皮內注射引起的免疫反應更強

7牛病毒性腹瀉病毒（BVDV) 以表達BVDV1型主要糖蛋白E2的質粒DNA肌肉注射小牛，可產生病毒中和抗體和抗原特異的細胞增殖反應；免疫后16周進行攻毒試驗，發現免疫牛能產生針對BVDV1型和2型的血清中和抗體強烈的記憶抗體反應，對牛有部分免疫保護作用

8新城疫病毒（DNV) Sakaguchi等（1996）將NDV F基因插入質粒載體，F基因的表達受巨細胞病毒早期增強子和雞β?肌動蛋白啟動子控制。1周齡試驗雞肌肉內注射重組質粒后，有2/5注射線性質粒的雞和4/5注射線性質粒與脂質體轉染劑混合物的雞產生了高水平針對F蛋白的抗體，而注射閉環狀質粒的雞不能產生抗體。免疫9周后，體內有抗體的試驗雞都能抵抗致死劑量NDV強毒的攻擊。

9雞傳染性喉氣管炎病毒（ILT) 將分別構建的含有雞傳染性喉氣管炎病毒王崗株gB、gC和gD基因的重組真核表達質粒及空載體質粒分組注射雛雞，攻毒后觀察免疫保護效果。結果表明，重組質粒誘導了免疫應答，免疫保護率達到79%，該基因疫苗可以作為預防ILV的1個補充。

10禽流感病毒 Robinson等（1993）最先將DNA疫苗用於雞，以編碼禽流感病毒H7N7株血凝素（HA）基因的質粒（DNA）由不同途徑（靜脈、腹腔、皮下注射）免疫3周齡雞，可對致死劑量的H7N7株病毒鼻內攻擊產生50%的保護。Fyna等（1993）為了研究DNA疫苗對雞最有效的免疫途徑，將100～200 μg編碼H7?HA的質粒DNA通過靜脈、肌肉、皮下注射、點眼、囊內、滴鼻等方式免疫3周齡雞。4周後進行第2次免疫。第6周，用致死劑量的H7N7攻擊，免疫雞的存活率達10%～63%，而對照組的存活率只有2%。

其中，多種途徑如靜脈和肌肉注射共同免疫的效果，比單一途徑如肌肉注射、點眼、法氏囊內、滴鼻免疫效果好。Kodihalli等（1997）將編碼H5?HA的質粒DNA以0.25、0.5、1.5或10 μg用基因槍免疫雞，4周后以100LD?50的Ty/lre/83株鼻內免疫進行攻擊，低至0.25 μg劑量的DNA可使50%的免疫雞存活。而1、5、10 μg的劑量可完全抵抗致死劑量病毒的攻擊。DNA疫苗對致死劑量的抗原變異株也可提供95%的保護，證實DNA流感疫苗具有廣闊的發展前景。DNA疫苗的安全性

雖然人們對於使用DNA疫苗的安全性存有疑慮，擔心DNA可能會整合到宿主細胞的染色體上而造成插入突變，但眾多研究結果並未發現有插入突變的現象。質粒DNA在動物體內會緩慢降解，不會造成動物的自體免疫（陳化蘭等，1998），也不隨卵子和精子傳入子代體內，它隨生物鏈進入其他物種體內時也會失活，而且對環境的污染很小，因此其危險性遠低於現用疫苗。