loading buffer

loading buffer的功能主要有兩個。第一，裡邊的指示劑溴酚藍和二甲苯氰FF起到指示的作用，顯示電泳的進程，以便我們適時終止電泳；第二，裡邊的成分甘油可以加大樣品密度，使樣品密度大於TAE，從而沉降到點樣孔中，防止樣品飄出點樣孔。另外，有的Buffer是加有SDS的，一般都會寫明。SDS主要是促使聚合酶變性，因為沒有除盡的聚合酶會結合在DNA雙鏈上影響它的遷移速率。細胞裂解后的裂解液，加loading 100℃加熱，也是為了中止酶促反應，防止提取的蛋白質降解。

6×loading buffer 一般配置：

6×Loading buffer:

30mM EDTA

36%(v/v) Glycerol

0.05%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.05%(w/v) Bromophenol Blue

主要用於DNA電泳

10×Loading buffer:

30mM EDTA

50%(v/v) Glycerol

0.25%(w/v) Xylene Cyanol FF

0.25%(w/v) Bromophenol Blue

主要用於RNA電泳

10 X loading buffer中僅有色素溴酚藍（Bromophenol Blue)一種染料（濃度0.05%）；

6 X loading buffer中含色素溴酚藍（Bromophenol Blue)、二甲苯腈藍FF（Xylene Cyanol FF)兩種染料（濃度都是0.05%）

在瓊脂糖凝膠（0.5% ~ 1.4%）中溴酚藍（Bromophenol Blue）約與300 bp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相同，二甲苯腈藍FF則與4 kbp的雙鏈線狀DNA的遷移速度相等。

6Xloading buffer是用來上樣的；10Xloading buffer是stop buffer，是停止酶促反應的，如果一定要用10Xloading buffer的上樣當然也可以，唯一要注意的是：10Xloading buffer中多了一樣SDS，它會使酶類如taq酶變性，以PCR產物為例，在電泳泳道上會產生一片彌散，如果電泳跑的距離短，和多出來一條帶沒有什麼區別（大概1000bp左右）。

5×SDS-PAGE Loading Buffer配製方法

組份濃度：

250mM Tris-HCl（pH6.8）

10%（W/V） SDS

0.5%（W/V） BPB

50%（V/V）甘油

5%（W/V） β-巰基乙醇

配製量： 5mL

配製方法：

1.量取下列試劑，置於10mL塑料離心管中。

1M Tris-HCl 1.25mL

SDS 0.5g

BPB 25mg

甘油 2.5mL

2.加入去離子水溶解后定容至5mL。

3.小份（500μl/份）分裝后，於室溫保存。

4.使用前將25μl的2-ME加到每小份中。

5.加入2-ME的Loading Buffer可在室溫下保存一個月左右。