基因轉移

最常用的將克隆重組的DNA片段導入哺乳動物細胞的方法是用磷酸鈣介導的轉染。轉染的DNA可能是通過吞飲作用進入細胞質，然後進入細胞核。

基因轉移是用物理的、化學的或生物學的方法將目的基因導入受體細胞並使之表達的一種技術。

物理方法

包括顯微鏡注射法、電脈衝介導法。顯微注射法是應用特別的玻璃顯微注射器在顯微鏡下把重組DNA導入靶細胞；電脈衝介導法又稱電穿孔法，是指在高壓電脈衝的作用下，使細胞膜上出現瞬間微小的孔洞，從而介導不同細胞之間的原生質膜發生融合，使外源DNA通過細膜上出現的瞬間小孔而進入細胞。

化學方法

有DNA-陽離子-二甲基亞碸法。基因轉移的生物學方法包括細胞融合法、脂質體介導法、原生質體融合法等。除以上三種方法外，又出現了顆粒轟擊技術，就是將外源DNA包被在金屬上，在電場中包被DNA的金屬顆粒獲得能量並以高速度運動，穿入靶細胞組織或器官內，由於這種金屬顆粒可以塗成薄膜狀，所以可實現較多細胞的基因轉移同時發生，改進了其它物理方法基因轉移效率低的缺點。

儘管物理法、化學法及生物學法在基因轉移中被廣泛應用，但由於基因轉移效率較低，在短時間內難以取得基因治療所需要的108~1012個轉化細胞，因而在基因治療的應用中仍然具有一定局限性，雖然對其進行了一些改造，如顆粒轟擊技術的處理和應用，但也不能完全克服以上缺點，故而在基因治療中不得不救助於其它技術，目前被廣泛應用的一種技術就是逆轉病毒載體技術（RMGT）。

逆轉錄病毒介導的基因技術

是目前將外源基因導入細胞的最有效的方法。此系統包括重組逆轉錄病毒載體和包裝細胞兩個部分，廣泛應用的逆病毒載體LNL6是以Moloney鼠白血病病毒（MO-MLV）改建的。該病毒為RNA病毒，感染細胞后，其基因組RNA經逆轉產生雙鏈DNA拷貝插入宿主染色體形成前病毒，前病毒轉錄產生正鏈即為病毒基因組RNA。整個基因組從5′端到3′端依次是：5′長末端重複順序（LTR）編碼病毒內部結構蛋白的gag基因，編碼蛋白的pol基因，編碼外殼蛋白的env基因以及3′LTR和一個介子5′LTR和gag基因之間的包裝信號。將病毒蛋白編碼區gag、pol、env全部切除，代之以外源性目的基因即改建為病毒載體，保留了LTR和包裝信號，是一種複製缺陷性病毒。同時，設計一種包裝細胞系，其內含有輔助病毒基因組，即為包裝信號缺乏的MO-MLV。當逆轉錄病毒載體進入包裝細胞系時，載體基因就被包裝形成完整的病毒顆粒，於是包裝細胞系就成了製造病毒載體的生產細胞系。將靶細胞與生產細胞系其同培養或是收集含有載體病毒的生產細胞繫上清液與靶細胞一起孵育，即可有效地進行基因轉移。逆轉錄病毒載體技術的優點在於轉染譜廣，可感染包括人體在內的多種動物細胞類型，一次可感染大量細胞，轉染率高達100%，轉染的基因可為單拷貝和少數拷貝，能準確地整合到宿主細胞基因組中，整合率高，且能長期有效地表達。

RMGT仍有不足之處

①載體的滴度較低；

②是輔助病毒與載體病毒重組重新獲得包裝信號使病人面臨感染輔助病毒的危險性；

③此載體只能整合至分裂相細胞；

④此載體容納的外源基因量較少，不利於較大的基因的插入。

因此，人們在努力改造包裝細胞系使其日趨完善，並廣泛用於體外及體內的基因治療中。在體外治療中，為了增強腫瘤病人骨髓細胞對化療藥物的敏感性，將骨髓細胞和帶有mdrI基因的逆轉錄病毒在體外共同培養后回輸體內，獲得了很高的療效；在體內治療中，用HSV-tk基因構建的逆轉錄病毒感染成纖維細胞后被直接注入鼠腦神經膠質瘤細胞中，再給予GCV治療，轉染了HSV-TK基因的膠質瘤細胞對GCV的易感性使得腫瘤完全消退了，目前，這項實驗的臨床應用階段尚未報道。

（1）配製下列溶液

①2×HEPES-緩衝鹽溶液（HBS）

②2mol/L CaCl2

③0.1×TE(pH8.0)用0.22μm濾器過濾除菌，分裝貯存於4℃。

④DNA：將DNA（約20μg/106細胞）溶於0.1×TE（pH8.0），使用濃度為40μg/ml。為使轉化效率達到最高，質粒DNA應用CsCl-溴化乙錠密度梯度平衡離心法純化。如果所用DNA量較少，應加入載體DNA將DNA濃度調至40μg/ml。實驗室製備的真核載體DNA轉染效率通常要比商品化的牛胸腺DNA、鮭魚精DNA高。載體DNA用前應通過乙醇沉澱或氯仿抽提進行滅菌。

（2）轉染前24h用胰蛋白酶進行消化以獲得對數生長期的細胞，以1～2×105細胞/cm2的密度重新種入60mm組織培養皿中。在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養箱中培養20～24h。

（3）每轉染一個60mm培養皿中的單層細胞，須依如下方法製備磷酸鈣-DNA共沉澱物：取步驟一所製備的DNA[40μg/ml，溶於0.1×TE(pH8.0)]220μl,2×HBs 250μl,放入一次性使用的滅菌5ml塑料管中，緩慢加入31μl 2mol/l 氯化鈣（溫和混合30s左右）。於室溫育20～30min，其間將形成細小沉澱。溫育結束時，用吸管將混合液吹打一次，使沉澱物懸浮。

通常採用的另一方案是將氯化鈣和DNA的稀釋混合液加入2×HBS溶液中，逐滴加入並小心混合250μl按步驟一製備並溶於氯化鈣（250mmol/L）的DNA。按照前述方法溫育之。

如果需要轉染更為大量的細胞，上述兩種反應混合液的體積均可翻一番或翻兩番。如果體積翻兩番，則須使用更大的塑料管，一般在25cm2細胞培養瓶或60mm細胞培養皿上，可將0.5ml磷酸鈣-DNA共沉澱物加入5ml培養液中，而在90mm細胞培養皿上，一般將1ml沉澱物加入10ml培養液中。

已經發表的方案中，混合各組分的方式與速率大不相同。其中有一些認為除了溫和振搖之外，其它措施均無濟於事，並建議用電動移液裝置吹出的空氣來混合溶液。其它一些方案則規勸在加入DNA溶液時連續而緩慢地混勻，然後再溫和振蕩。其目的是為了避免急速形成粗沉澱物，以致降低轉化效率。實際上，除了混合的速度之外，還有其它若干因素包括DNA的濃度和大小（讓高分子量DNA從細針頭中通過，可將之剪切變小）、緩衝液的精確pH（有些工作者配製了幾批pH範圍從6.95至7.1不等的HBS緩衝液，逐批試驗沉澱物的質量及轉染效率）。如果必須使轉染效率達到最高，就要花時間針對特定的系統優化上述幾種因素。一旦得到一批靈驗的試劑，只需依照前面方法進行配製和貯存，即可在長期內獲得可重複的結果。

（4）將磷酸鈣-DNA懸液轉移至細胞單層上的培養液中[在60mm培養皿中，可將0.5ml懸液加入5ml培養液中]，輕輕左右晃動一下培養皿使培養液得以混合，此時可見培養液成黃橙色渾濁狀。另一方法是吸出培養液，直接把沉澱物加到細胞上，將細胞置於室溫溫育15min，然後再將培養液加回到培養皿中，此時細胞上有許多細小顆粒。採用以上兩種方法，都要在37℃、5%～7%CO2及一定濕度的培養箱中將轉染細胞培養長達24h[時間的長短取決於後續處理步驟的不同，見步驟（5）]。

（5）然後，轉染細胞可依以下任一種方法處理：

①如果不進行其它處理（如用氯喹、甘油或丁酸鈉等試劑處理，見后），可在細胞培養16～24h后，吸出培養液和沉澱物，用PBS將單層細胞再洗一次。然後按下述③d操作。

②在許多情況下，同時用氯喹處理細胞，可提高DNA攝入率。氯喹可能是通過抑制溶酶體水解酶類對DNA的降解而起作用的。氯喹濃度及其處理時間不能超越細胞對其毒性作用的耐受能力。因此必須通過預實驗來決定適於所用特定型別細胞的最佳氯喹濃度。但對於大部分型別的細胞，用終濃度為100μmol/L的氯喹處理3～5h，都可取得良好效果。可在磷酸鈣-DNA共沉澱物加入細胞之前或之後（見步驟（4）介紹的其它方法），直接將氯喹二磷酸貯存液（過濾除菌並貯於-20℃用金屬泊密封的管中，100mmol/L）稀釋（1：100）於培養液中。在氯喹處理過程中，細胞呈現泡狀是正常的。經用DNA和氯喹處理3～5h后，棄去培養液和沉澱，用PBS洗，然後按下述d操作。

③用甘油短暫處理細胞，同樣可提高轉化效率或導入DNA的瞬時表達水平。這一步驟可以在氯喹處理之後進行。由於不同細胞對甘油的毒性作用的敏感性相差懸殊，因此每種型別的細胞都必須通過預實驗決定最佳處理時間（從30s至3min）。耐受甘油的細胞可以暴露於含磷酸鈣-DNA共沉澱物（含或不含氯喹）的生長液3～5h後進行休克。

a. 吸出生長液，用PBS將單層細胞洗1次

b.在單層細胞中加入1.5ml溶於1×HBS的15%甘油，在37℃培養0.5～3min

c.吸出甘油，用PBS將單層細胞洗1次

d.加入5ml預加溫的完全生長液，放入培養箱中繼續培養24～60h后，檢測DNA的瞬時表達或將細胞重新種入適當的選擇性培養基中，分離穩定的轉化體。

④業以表明，丁酸鈉也可以在猴源和人源細胞中增強帶SV40早期啟動子/增強子的重組質粒的表達。可直接在生長液中加入有關試劑，也可以使經過甘油休克的細胞接受丁酸鈉處理。須視細胞型別的不同，採用不同濃度的丁酸鈉（500mmol/L貯存液，在化學通風櫥中用NaOH中和丁酸製備而成），例如：

CV-1　10mmol/L

NIH-3T3　7mmol/L

HelaS3　5mmol/L

CHO 2mmol/L

不加完全生長液，然後重複步驟d。

（6）轉移基因表達和細胞集落形成

①瞬時表達：在轉染后48～60h收穫細胞，進行RNA或DNA雜交分析。新合成的蛋白質可以用放射免疫測定Western印跡，體內代謝標記－免疫沉澱或者細胞提取液中酶活性的測定等方法來進行分析，如果測定中有重複品或者轉染細胞要經過多種不同條件或在一段時間歷程以內取不同時間進行處理，就要避免皿與培養皿之間轉染效率的偏差。在這些情況下，最好轉染大片的單層細胞（90mm培養皿），培養24h後用胰蛋白酶進行消化，再分接到若干較小的培養皿上。

②穩定轉化：在非選擇性培養基中培養18～24h，使所轉移基因得到表達之後，用胰蛋白酶消化細胞，種入適當的選擇性培養基中。這種培養基在2～3周內每2～4d須更換1次，以便除去死細胞殘骸並使抗性細胞集落得以生長。

可以克隆單個細胞集落，增殖後進行測定。可以用冰預冷的甲醇將仍保留在培養皿內的細胞固定15min，再於室溫用10%Giemsa染色15min，最後用自來水沖洗，這樣即可得到細胞集落數的永久記錄。Giemsa染液可用PBS或水現用現配，並用Whatman 1號濾紙過濾。

重新接種細胞以便取得分隔良好的細胞集落所要求稀釋倍數，主要由穩定轉化的效率來決定。這一效率可以相差若干個數量級，它起決於：a.受體細胞的型別（即使同一細胞系，克隆不同或傳代數不同，也表現出顯著差異）；b.導入基因的特性及其轉錄調控信號強弱；c.轉染中所用供體DNA的量。