靶基因

檢測鼻咽癌中信號傳導與轉錄激活因子（signal transduction and activators of transcription，STATs）Stat3及其靶基因產物與VEGF的表達，探討其在鼻咽癌發生髮展中的作用。方法 採用免疫組化技術檢測慢性鼻咽炎29例，人鼻咽癌活檢組織60例，鼻咽癌頸部淋巴結轉移28例Stat3、Cyclin D1、Bcl-xL和VEGF蛋白的表達。結果 鼻咽癌中Stat3及其靶基因產物（Bcl-xL Cyclin D1）、VEGF明顯高於鼻咽粘膜慢性炎；鼻咽癌與鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶中Stat3及其靶基因產物表達比較在統計學上差異無顯著性。在鼻咽癌組織及鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶中Stat3、Cyclin D1與VEGF的表達有顯著相關性，而Bcl-xL和VEGF的表達無顯著相關性。結論 Stat3及其靶基因產物與VEGF可能在鼻咽癌的發生髮展及轉移中發揮重要作用。二者之間的相關性表明VEGF基因可能由STAT3蛋白調節。 Relationship of Stat3with its target gene products and VEGF in nasopharyngeal carcinoma Yao Yunhong，Li Feihong，Cai iongzhen，et al. Department of Pathology，Guangdong Medical College，Zhanjiang524023.

靶基因 - Abstract

Objective To investigate the relationship between stat3with its target gene products including Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in Nasopharyngeal carcinoma（NPC），and to explore the mechanism tumorigenesis of NPC.Methods The expressions of stat3、Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF proteins in paraffin-embedded specimens of29cases of chronic nasopharyngitis，60cases of NPC and28cases of lymph-node metastasis were studied by imˉmunohistochemical method（SABC）.Results The positive rate of stat3、Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in chronic naˉsopharyngitis were41.38%（12/29），34.48%（10/29），27.59%（8/29），24.13%（7/29）respectively;the expresˉsion of Stat3Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in nasopharyngeal carcinoma were73.33%（44/60）、68.33%（41/60）、55.00%（33/60）、80.00%（48/60）with significant difference compared with chronic nasopharyngitis pectively;The positive rate of stat3、Bcl-xL、Cyclin D1and VEGF in lymph-node metastasiswere85.71%（24/28），75.00%（21/28），71.43%（20/28），82.14%（23/28）with significant difference compared with chronic nasopharyngitis reˉspectively，There were no significant difference between NPC and lymph-node metastasis.Spearman correlation analyˉsis showed there were significant correlation between the expression of stat3、Cyclin D1and VEGF in NPC and lymph nodes metastasis.Conclusion stat3and VEGF may play an important role in the development of NPC，VEGF gene may be regulated directly by stat3protein. Key words nasopharyngeal carcinoma Stat3 VEGF

靶基因 - 鼻咽癌

（Nasopharyngeal carcinoma，NPC）是具有顯著種族及地理分佈特點的惡性腫瘤，以我國華南及東南亞地區高發，95%以上屬於低分化和未分化癌類型，惡性度高、生長快、容易出現淋巴或血行轉移。侵襲和轉移是其最本質的生物學特徵，也是導致病人死亡的主要原因。腫瘤的發生髮展都離不開新生血管生成，以獲得腫瘤細胞生長和轉移所需的營養物質。因此，抑制腫瘤血管生成已成為當前腫瘤治療的重要策略。血管內皮生長因子（VEGF）是最重要的血管生成因素之一，有報道VEGF基因直接由信號傳導與轉錄激活因子（signal transduction and activators oftranscription，STATs）蛋白調節[1]。本實驗對慢性鼻咽炎、鼻咽癌和鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶標本進行了Stat3及其靶基因產物（cyclin D1、Bcl-xL）和VEGF表達的檢測，並探討二者之間表達的關係，為鼻咽癌的抗血管生成治療提供依據。

1.1 一般資料 經病理診斷證實的慢性鼻咽炎29例，人鼻咽癌活檢組織60例，鼻咽癌頸部淋巴結轉移28例。按WHO分型均為鼻咽分化型非角化性癌（由廣東醫學院第二附屬醫院耳鼻喉科和高州市人民醫院耳鼻喉科提供）。所有病例資料完整，鼻咽癌及鼻咽癌頸部淋巴結轉移病人診斷前未經任何抗癌治療。標本均用10%福爾馬林固定。常規脫水、透明、浸蠟、包埋、切片。1.2 免疫組化方法 按常規ABC方法進行免疫細胞化學染色。檢測Stat3、Cyclin D1、Bcl-xL和VEGF蛋白的表達。使用抗體均購於Doka公司，所用抗體的工作濃度：鼠單抗Stat3為1:50PBS稀釋，Cyclin D1為1:50PBS稀釋、Bcl-xL和VEGF為1:100PBS稀釋，ABC Kit為Vector產品。1.3 結果判斷 每一批免疫組化均設有已知的陽性和用PBS代替的陰性對照。觀察切片至少5具有代表性高倍視野，不少於1000個細胞，對免疫組化結果進行評估。Bcl-xL和VEGF蛋白表達定位於細胞質，癌細胞染成棕黃色者為陽性細胞。判斷方法為鏡下觀察：陽性細胞<10%為陰性表達;10%～50%為陽性表達;>50%為強陽性表達。Stat3、Cyclin D1主要定位於細胞核，部分定位於細胞質，結果判斷參考文獻進行 [2] :（1）按陽性細胞百分率計分：陽性細胞<10%計0分;10%～50%計1分;>50%計2分。（2）按染色強弱計分：淡黃色計0分；黃色計1分；棕黃色計2分。兩項合併得0～1為陰性;2～3陽性;4分為強陽性。1.4 統計學處理 採用SPSS10.0做卡方檢驗和Spearman相關分析。

2.1 Stat3、Cyclin D1、Bcl-xL和VEGF蛋白在鼻咽良惡性病變中的表達 29例鼻咽粘膜慢性炎中Stat3陽性表達為41.38%（12/29），Bcl-xL陽性表達為34.48%（10/29），Cyˉclin 1陽性表達為27.59%

（8/29），VEGF陽性表達為24.13%（7/29）;60例鼻咽癌中Stat3、Bcl-xL、Cyclin D1和VEGF表達陽性率分別為73.33%（44/60）、68.33%（41/60）、55.00%（33/60）、80.00%（48/60）;與鼻咽粘膜慢性炎組比較Stat3、CyclinD1、Bcl-xL和VEGF差異均有顯著性（P<0.05）。28例鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶中Stat3表達陽性率為85.71%（24/28），Bcl-xL表達陽性率為75.00%（21/28），Cyclin D1表達陽性率為71.43%（20/28），VEGF表達陽性率為82.14%（23/28）;與鼻咽癌組比較差異均無顯著性（P>0.05）。見表1。表1 多基因蛋白在鼻咽良惡性病變中的表達 例（略）注:①鼻咽癌與鼻咽粘膜慢性炎比較P<0.05;②鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶與鼻咽癌比較P>0.05。2.2 鼻咽癌中Stat3、Bcl-xL、Cyclin D1和VEGF表達的相關分析 經Spearman相關性分析結果；在鼻咽癌組織中Bcl-xL和VEGF的表達無顯著相關性（分別r=0.124，P>0.05），Stat3、Cyclin D1與VEGF的表達有顯著相關性（分別r=0.397，P<0.05;r=0.457，P<0.05）。

2.3 鼻咽癌頸淋巴結轉移灶中Stat3、Bcl-xL、Cyclin D1和VEGF表達的相關分析 經Spearman相關性分析結果：在鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶中Bcl-xL和VEGF的表達均無顯著相關性（分別r=0.158，P>0.05），Stat3、Cyclin D1與VEGF的表達有顯著相關性（r=0.413，P<0.05;r=0.437，P<0.05）。

Stats由Fu等 [2] 首次鑒定，癌細胞的增殖由STAT基因啟動，經過JAK/STAT信號轉導（JAK/STAT signaling）及CDK的調節，然後分裂繁殖。的研究顯示，Stat3在多發性骨髓瘤、頭頸部鱗狀細胞癌、乳腺癌以及前列腺癌等多種腫瘤組織與細胞系中異常表達或活性增強 [3] ，提示Stat3調控異常與腫瘤發生、發展密切相關。馬向濤 [4] 對結直腸癌研究發現Stat3信號轉導通路可能在結直腸癌的發生、發展過程中起重要作用，檢測結直腸癌中Stat3及其靶基因產物的表達可以反映腫瘤的惡性程度。本實驗顯示在鼻咽癌組織內Stat3及其靶基因產物的表達明顯高於慢性鼻咽炎組，提示Stat3過度表達可能在鼻咽癌的發生、發展過程中發揮重要作用，其表達與鼻咽癌淋巴結轉移密切相關。腫瘤侵襲、轉移與血管生成密切相關，血管內皮生長因子（VEGF）是最重要的血管生成因素之一，血管內皮生長因子通過與其受體的相互作用調控血管生成，血管新生對於原發癌和轉移癌的生長都十分重要，在腫瘤組織中VEGF表達亢進，與腫瘤組織的微血管密度、預后及轉移密切相關，此外VEGF與一些癌基因表達密切相關 [5]。VEGF阻止 劑通過抑制血管增生，抑制腫瘤和微小轉移灶的形成，達到治療腫瘤的目的。本研究結果顯示，在鼻咽癌及鼻咽癌頸淋巴轉移組織中VEGF明顯高於慢性鼻咽炎組織，表明VEGF可能在鼻咽癌的生長及轉移中發揮重要作用。有研究報道 [6]在胰腺癌Stat3可能直接調節VEGF，從而調節腫瘤的血管形成。Niu等 [6]用顯性陰性的Stat3蛋白（即Stat3b，一種Stat3的突變形式），可抑制Stat3的活性及Stat3反義寡核苷酸阻斷Stat3的信號轉導，均可下調VEGF的表達，同時他們通過染色質免疫沉澱檢測，發現Stat3蛋白在體內結合於VEGF的啟動子，且VEGF啟動子上Stat3結合位點的突變會使v-src介導的VEGF啟動子的活性喪失，因此，他們認為VEGF基因是直接通過Stat3蛋白來調節的，並且認為Stat3在阻斷由多種信號途徑介導的腫瘤血管生成策略中是一個共同的分子靶。也就是說阻斷Stat3即可阻斷血管生成，阻止腫瘤的生長和轉移。在鼻咽癌及鼻咽癌頸淋巴結轉移組織中Stat3及其靶基因產物（cyclin D1）表達與VEGF密切相關，能否通過阻斷Stat3阻止鼻咽癌的生長和轉移，有待進一步研究。有研究報道抑制Stat3表達及活性可使凋亡抑制蛋白Bcl-XL表達明顯下調，Stat3可能通過調控Bcl-xL而影響頭頸部鱗癌細胞凋亡。Masuda [7]等發現，Stat3持續活化與HNSCC分期及淋巴結轉移相關 [8]，Stat3是癌基因，但是它本身並不直接引起癌變，而是通過激活其靶基因而誘導某些關鍵基因產物的表達來影響腫瘤發生，其中包括調節細胞周期的cyclin D1和影響凋亡的BcL-xL。Huang等 [9]發現Stat3在卵巢癌細胞系MDAH2774與CAOV-3中持續激活，阻斷Stat3活化可以抑制Cyclin D1蛋白表達。Cyclin D1可通過調節細胞周期使之始終處於旺盛分裂狀態而促使細胞惡性變。已發現多種腫瘤中都有Cyclin D1的高表達，是以細胞增殖能力旺盛，能夠不斷分裂增殖而最終形成腫瘤。本研究發現：鼻咽癌組織和鼻咽癌頸部淋巴結轉移灶Stat3表達與活性升高，cyclin D1表達變化趨勢與Sta3同步，鼻咽癌組織中Stat3與Cyclin D1表達情況呈線性正相關，其可能機制是Stat3與CyclinD1啟動子上的Stat3位點結合而啟動轉錄，促進癌細胞增殖而導致鼻咽癌發生。凋亡抑制因子BcL-xL是Stat3的另一重要靶基因產物。應用Stat3顯性負性質粒阻斷骨髓瘤U266細胞中的Stat3通路后，可以觀察到BcL-xl蛋白表達下調，U266細胞凋亡數量增多 [10]。Burke等 [11]應用酪氨酸激酶抑製劑AG490作用於卵巢癌細胞系DAH2774與CAOV-3，發現Stat3蛋白表達與活性降低，凋亡抑制蛋白BcL-xL表達同步下調，卵巢癌細胞出現凋亡。本研究發現：鼻咽癌中Stat3及BcL-xL表達升高，但是統計學分析並沒有相關性，鼻咽癌中Stat3對Bcl-xL的調控機制還需進一步研究。總之，Stat3信號轉導通路異常活化可能在鼻咽癌的發生、發展過程中起重要作用。