重組子
重組子
重組子(recon):兩個位於不同載體或染色體上的突變位點之間可發生交換產生野生型的最小單位,即不能由重組分開的基本單位。重組子(recombinant)另一定義是指,含有重組DNA分子的轉化細胞。
重組子(recon):兩個位於不同載體或染色體上的突變位點之間可發生交換產生野生型的最小單位,即不能由重組分開的基本單位。
重組子(recombinant), 含有重組DNA分子的轉化細胞。
轉化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羥基-鈣磷酸複合物黏附於細胞表面,經42℃短時間熱激處理,促進細胞吸收DNA複合物。進入細胞的DNA分子通過複製、表達,實現遺傳信息的轉移,使受體細胞出現新的遺傳性狀。
根據載體的遺傳特徵篩選重組子,如α-互補、抗生素基因等。至今使用的許多載體都帶有一個大腸桿菌的DNA的短區段,其中有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的調控序列和前146個氨基酸的編碼信息。在這個編碼區中插入了一個多克隆位點(MCS),它並不破壞讀框,但可使少數幾個氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影響功能,這種載體適用於可編碼β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主細胞。因此,宿主和質粒編碼的片段雖都沒有酶活性,但它們同時存在時,可形成具有酶學活性的蛋白質。這樣,LacZ基因在缺少近操縱基因區段的宿主細胞與帶有完整近操縱基因區段的質粒之間實現了互補,稱為α-互補。由α-互補而產生的LacZ+細菌在誘導劑IPTG的作用下,在生色底物X-Gal存在時產生藍色菌落,因而易於識別。然而,當外源DNA插入到質粒的多克隆位點后,幾乎不可避免地導致無α-互補能力的氨基端片段,使得帶有重組質粒的細菌形成白色菌落。這種重組子的篩選,又稱為藍白斑篩選。如用藍白斑篩選則經連接產物轉化的鈣化菌平板37℃溫箱倒置培養12-16hr后,有重組質粒的細菌形成白色菌落。
這和受體菌:質粒DNA的選擇相關,原則上要注意:
1、受體菌必須是限制與修飾系統缺陷的菌株;
2、根據質粒基因型和受體菌基因型互補原則而定;
重組子的篩選方法常用的有兩種方法: