毛狀根培養
毛狀根培養
毛狀根培養是20 世紀80 年代發展起來的基因工程和細胞工程相結合的一項技術，通過將髮根農桿菌( Agrobacterium rhizogenes) 中Ri 質粒含有的T-DNA 整合到植物細胞的DNA 上，誘導植物細胞產生毛狀根。毛狀根屬於激素自養型，具有有效成分含量高、生理生化和遺傳性穩定、易於進行操作控制等特點，可在離體培養條件下表現出次生代謝產物的合成能力，還能夠合成許多懸浮細胞培養所不能合成的物質，某些產物的產量甚至高於正常植物及懸浮細胞培養。可見，毛狀根培養系統無論在生物量的增加，藥用有效成分的積累還是生產穩定性方面，都顯示了其獨特的優越性，使得利用毛狀根培養生產植物次生代謝產物具有極大的生產潛力。到目前為止，國內外現已成功地培養出天仙子、黃芪、紫草、紅花、青蒿、決明等藥用植物的毛狀根，人蔘皂甙、黃連素等已通過毛狀根培養得以工業化生產。而如何實現藥用植物毛狀根的大規模培養，以及提高毛狀根中有效次生代謝物的積累能力，成為眾研究者關注的焦點。
(Agrobacterium rhizogenes)是一種革蘭氏陰性菌，能侵染大多數的雙子葉植物、少數單子葉植物及個別的裸子植物，誘發被感染植物的受傷部位長出毛狀根。髮根農桿菌之所以具有這種致根性，是因為它具有能誘導毛狀根產生的Ri質粒。Ri質粒是髮根農桿菌染色體外的一個約250kb的大質粒，帶有冠癭合成酶基因。在Ri質粒上，存在與轉化有關的兩個主要功能區，即T-DNA (轉移區)和Vir (致病區)。Vir區基因並不發生轉移，但它對T-DNA的轉移非常重要。當髮根農桿菌感染植物時Ri質粒上的T-DNA可以轉化並插入到植物細胞基因組中，其整合和表達的結果導致了大量毛狀根的產生。處理菌株后可提高Vir區的表達並明顯提高藥用植物外植體的轉化率。
髮根農桿菌Ri質粒有幾種不同的類型，分別是農桿鹼型、甘露鹼型和黃瓜鹼型。其中含有農桿鹼型Ri質粒的菌株通常具有更廣泛的宿主範圍和更強的致根特性。
經髮根農桿菌侵染植物形成的毛狀根適離體培養能夠再生植株，而且許多植物的毛狀根在離體培養條件下表現出次生代謝產物的合成能力，產物產量較正常植物及懸浮培養細胞的要高。因此Ri質粒可應用於有價值的次生代謝產物的生產。
與植物細胞培養相比，毛狀根培養具有生長速度快、激素自養、分化程度較高以及遺傳性狀相對穩定等優點。由於近三分之一傳統藥材的藥用部位是根，所以這一培養系統在傳統藥材生產中具有更重要的意義。
常用於實驗的髮根農桿菌（ Agrobacterium rhizogenes ）有：ATCC15834、ATCC39207、G58P GV3296、A4、NCPPB2659、Rl500、Rl601、LBA9402、TRl05等菌株，這些菌株中含有侵入性致根質粒（root inducing plasmid）Ri質粒。
（以黃芪為例簡述毛狀根的誘導方法）：①黃芪無菌苗培養：黃芪種子表面消毒後接種於MS培養25 ℃下暗培養，待苗長至4cm左右時取其不帶芽的下胚軸作為共培養的材料。
②髮根農桿菌的培養與保存：農桿菌可在平板培養基上於4℃下保存數月，而在-70 ℃的低溫冰箱中可長期保存。農桿菌快速生長過程中．常常會出現質粒丟失，基因突變。要使轉化最為有效就要利用對數生長期的農桿菌來轉化。髮根農桿菌15834的質粒上帶有抗cefotaximes選擇標記基因，將農桿菌培養於YEB培養基上， 25 C下培養，每周轉接一次，感染前兩天轉接一次。
③針刺接種感染與共培養：把黃芪下胚軸切段后，用解剖針蘸取培養好的髮根農桿菌，在黃芪下胚軸上扎眼，之後黃芪切段接種於含500mg/L cefotaxime的MS培養基上培養。25℃黑暗下誘導毛狀根。長出的毛狀根經多次轉接去除農桿菌之後轉入MS中培養可速生長，轉化的毛狀根生長大大快於未轉化的根培養物。
誘導出的毛狀根是否確為轉基因產物還需鑒定。毛狀根可以從形態水平上給於鑒定，它不依賴激素快速生長，根多叢生，多分枝，多根毛，無向地性。這些表型的特徵與未轉化的根不同，可區分開。可以通過毛狀根中GUS活性的測定或NPTII酶的檢測從組織水平來證明Ri質粒中的T－DNA是否轉移整合到植物細胞的核因組上。
冠癭鹼的測定可作為細胞水平的毛狀根鑒定方法，因為冠癭鹼合成酶基因在髮根農桿菌中並不能表達，它只能在植物細胞中表達。冠癭鹼的存在可作為植物細胞轉化的指標。冠癭鹼的測定可用高壓紙電泳方法，用鹼性硝酸銀溶液染色，硫代硫酸鈉溶液固定。
1.《藥用植物學與生藥學》人民衛生出版社 主編 鄭漢臣，蔡少青2003年第四版
3.《中華本草》
基本信息
- 分類
- 三種
- 性質
- 革蘭氏陰性菌