DNA重組

外源DNA和質粒載體的連接

外源DNA片段和線狀質粒載體的連接，也就是在雙鏈DNA5'磷酸和相鄰的3'羥基之間形成的新的共價鏈。如質粒載體的兩條鏈都帶5'磷酸，可生成4個新的磷酸二酯鏈。但如果質粒DNA已去磷酸化，則吸能形成2個新的磷酸二酯鏈。在這種情況下產生的兩個雜交體分子帶有2個單鏈切口（圖1.8），當雜本導入感受態細胞后可被修復。相鄰的5'磷酸和3'羥基間磷酸二酯鍵的形成可在體外由兩種不同的DNA連接酶催化，這兩種酶就是大腸桿菌DNA連接酶和T4噬菌體DNA連接酶。實際上在有克隆用途中，T4噬菌體DNA連接酶都是首選的用酶。這是因為在下述反應條件下，它就能有效地將平

端DNA片段連接起來。

DNA一端與另一端的連接可認為是雙分子反應，在標準條件下，其反應速度完全由互相匹配的DNA末端的濃度決定。不論末端位於同一DNA分子（分子內連接）還是位於不同分子（分子間連接），都是如此。現考慮一種簡單的情況，即連接混合物中只含有一種DNA，也就是用可產生粘端的單個限制酶切割製備的磷酸化載體DNA。在加作用的底物。如果反應中DNA濃度低，則配對的兩個末端同一DNA分子的機會較大（因為DNA分子的一個末端找到同一分子的另一末端的概率要高於找到不同DNA分子的末端的概率）。這樣，在DNA濃度低時，質粒DNA重新環化將卓有成效。如果連接反應中DNA濃度有所增高，則在分子內連接反應發生以前，某一個DNA分子的末端碰到另一DNA分子末端的可能性也有所增大。因此在DNA濃度高時，連接反的初產物將是質粒二聚體和更大一些的寡聚體。Dugaiczyk等(1975;同時參見Bethesda Res,Lab.出版的Focus第2卷，第2、3期合刊）從理論上探討了DNA濃度對連接產物性質的影響。簡而言之，環化的連接產物與多聯體連接產物的比取決於兩個參數：j和i。j是DNA分子的一個末端在同一分子的另一末端附近的有效濃度，j的數值是根據如下一種假設作出的：沉吟液中的DNA呈隨機捲曲。這樣，j與DNA分子的長度成反比（因為DNA越長，某一給定分子的兩末端的越不可能相互作用），因此j對給定長度的DNA分子來說是一個常數，與DNA深度無關。j=[3/(3πlb0)]3/2其中l是DNA長度，以cm計，b是隨機捲曲的DNA區段的長度。b的值以緩衝液的離子強度為轉移，而後者可影響DNA的剛度。

i是溶液中所有互補末端的深度的測量值，對於具有自身互補粘端的雙鏈dna而言，i=2NoMx10-3末端/ml這裡No是阿佛伽德羅常數，M是DNA的摩爾濃度（單位：mol/L)。理論上，當j=i時，給定DNA分子的一個末端與同一分子的另一末端，以及與不同分子的末端相接觸的可能性相等。因而在這樣的條件下，在反應的初始階段中，環狀分子與多聯體分子的生成速率相等。而當j>i時，有利於重新環化；當i>j，則有利於產生多聯體。圖1.9顯示了DNA區段的大小與連接反應混合物中j:i之比分別為0.5、1、2和5時所需DNA濃度之間關係（Dugaiczyk等，1985）。現在考慮如下的連接反應混合物：其中除線狀質粒之外，還含有帶匹配末端的外源DNA片段。對於一個給定的連接混合物而言，產生單體環狀重組基因組的效率不僅受反應中末端的絕對濃度影響，而且還受質粒和外源DNA末端的相對濃度的影響。當i是j的2－3倍（即末端的絕對濃度足以滿足分子間連接的要求，而又不致引起大量寡聚體分子的形成時）外源DNA末端濃度的2倍時，有效重組體的產量可達到最大。這些條什下，連接反應終產物的大約40%都是由單體質粒與外源DNA所形成的嵌合體。當連接混合物中線性質粒的量恆定（j:i=3）而帶匹配末端的外源DNA的量遞增時，這種嵌合體在連接反應之末的理論產量。

涉及帶粘端的線狀磷酸化質粒DNA的連接反應應包含：

1）足量的載體DNA，以滿足j:i>1和j:i<3。對一個職pUC18一般大小的質粒，這意味著連接反應中應含有載體DNA為20-60μg/ml。

2）末端濃度等於或稍高於載體DNA的外源DNA，如外源DNA濃度比載體低得多，在效連接產物的數量會很低，這樣就很難別小部分帶重組抽粒的轉化菌落。這種情況下，可考慮採用一些步驟來減少帶非重組質粒的背景菌落。如用磷酸酶處理線狀質粒DNA或發跡克隆策略以便通過定向克隆的方法構建重組質粒。

1）用適當的限制酶消化質粒和外源DNA。如有必要，可用凝膠電泳分離片段並（或）用鹼性磷酸酶處理質粒DNA。通過酚：氯仿抽提和乙沉澱來純化DNA，然後用TE(pH7.6)溶液使其濃度為100/ml。

2）按如下所述設立連接反應混合物：

a．將0.1μl載體DNA轉移到無菌微量離心管中，加等摩爾量的外源DNA。

b．加水至7.5μl，於45℃加溫5分鐘以使重新退炎的粘端解鏈，將混合物冷卻到0℃。

c．加入：10xT4噬菌體DNA連接酶緩衝液 1μl

T4噬菌體NDA連接酶 0.1Weiss單位

5mmol/L ATP 1μl

於16℃溫育1－4小時

10xT4噬菌體DNA連接酶緩衝液

200mmol/L同Tris Cl(pH7.6)

50mmol/K MgCl2

50mmol/L二硫蘇糖醇

500μg/ml牛血清白蛋白（組分V.Sigma產品）（可用可不用）

該緩衝液應分裝成小份，貯存於－20℃。

另外，再設立兩個對照反應，其中含有（1）只有質粒載體；（2）只有外源DNA片段。如果外源DNA量不足，每個連接反應可用50-100ng質粒DNA，並儘可能多加外源DNA，同時保持連接反應體積不超過10μl。可用至少3種不同方法來測定T4噬菌體DNA連接酶的活性。大多數製造廠商（除New England Biolabs公司外）現在都用Weiss等，11968)對該酶進行標化。1個Weiss單位是指在37℃下20分釧內催化1mmol32P從焦磷酸根置換到[γ,β-32P]ATP所需酶時，1個Weiss單位相當於0.2個用外切核酸酶耐受試驗來定義的單位（Modrich和Lehman,1970)或者60個粘端單位（如New England Biolabs公司所定義）。因此，0.015Weiss單位的T4噬菌體DNA連接酶在16℃下30分鐘內可使50%的λ噬菌體HindⅢ片段（5μg）得以連接。在本書中，T4噬菌體DNA連接酶一律用Weiss單位表示。\par 目前提供的T4噬菌體DNA連接酶均為濃溶液（1-5單位/μl），可用20mmol/L (pH7.6)、60mmol/L KCl、5mmol/L二硫蘇糖醇、500μg/ml牛血清白蛋白、50%甘稀釋成100單位/ml的濃度置存。處於這種濃度並在這種緩衝液中的T4噬體DNA連接酶於-20℃保存3個月可保持穩定。

3）每個樣品各取1－2μl轉化大腸桿菌感受態細胞。

T4噬菌體DNA連接酶不同於大腸桿菌DNA連接酶，它可以催化平端DNA片段的連接（Sgaramella和Khorana,1972;Sgaramella和Ehrlich,1978），由於DNA很容易成為平端，所以這是一個極為有用的酶學物性。有了這樣的物性，才能使任何DNA分子彼此相連。然而，相對而言，平端連接是低效反應，它要求以下4個條件：

1）低濃度（0.5mmol/L）的ATP(Ferretti和Sgaranekka,1981）。

2）不存在亞精胺一類的多胺。

3）極高濃度的連接酶（50Weiss單位．ml）。

4）高濃度的平端。

1．凝聚劑

在反應混合物中加入一些可促進大分子群聚作用並可導致DNA分子凝聚成集體的物質，如聚乙二醇（Pheiffer和Zimmerman,1983;Zimmerman和Pheiffer,1983;ZimmermanT Harrison,1985)或氯化六氨全高鈷（Rusche和Howard-Flanders,1985）,可以使如何取得適當濃度的平端DNA的總是迎刃而解。在連接反應中，這些物質具有兩作用：

1）它們可使平端DNA的連接速率加大1－3個數量級，因此可使連接反應在酶DNA濃度不高的條件下進行。

2）它們可以改變連接產物的分佈，分子內連接受到抑制，所形成的連接產物一律是分子間連接的產物。這樣，即使在有利於自身環化（j:i=10）的DNA濃度下，所有的DNA產物也將是線狀多聚體。\par 在設立含凝聚劑的連接反應時，下列資料可供參考。

（1）聚乙二醇（PEG8000）

1）用去離子水配製的PEG8000貯存液（40%）分裝成小份，冰凍保存，但加入連接反應混合物之前應將其融化並使其達到室溫。在含15%PEG 8000的連接反應混合物中，對連接反刺激效應最為顯著。除PEG 800和T4噬菌體DNA連接酶以外，其他所有連接混合物的組分應於0℃混合，然後加適當體積的PEG 8000（處於室溫），混勻，加酶後於20℃進行溫育。

2）連接混合物中含0.5mmol/L ATP和5mmol/L MgCl2時對連接反應的刺激效應最為顯著，甚至ATP濃度略有增加或MgCl2濃度略有降低，都會嚴重降低刺激的強度（Pheiffer和Zimmerman,1983）。

3）濃度為15%的PEG 8000可刺激帶粘端的DNA分子的連接效率提高至原來的10-100倍，反應的主產物是串聯的多聯體。

4）PEG 8000可刺激短至8個核苷酸的合成寡聚物的平端連接，在這一方面，它與氯化六氨合高鈷有所不同。

（2）氯化六氨合高鈷

1）氯化六氨合高鈷可用水配成10mmol/L貯存液貯存於-20℃，它對連接反應的刺激具有高度的濃度信賴性。當連接反應混合物中鹽深度為1.0-1.5μmol/L時，其刺激作用最大。氯化六氨合高鈷可使平端連接的效率大約提高到原來的50W部，但只能使端連接的效率提高到原來的5倍（Rusche和Howard-Flanders,1985）。

2）在單價陽離子（30mmol/L KCl）存在下，它對平端連接仍有一定的刺激作用，但此時連接產物的分佈有所改變。連接產物不再是清一色的分子間連接產物，相反，環狀DNA將點盡優勢。

3）與PEG 8000不同，氯化六氨合高鈷不能顯著提高合成寡核苷酸的連接速率。

質粒克隆中最慢的步驟是所需的外源DNA片段和相應質粒DNA區段的電泳純化，下面的操作方案[由S.Michaelis(個人通訊）根據Struhl(1985)的方法修訂而成]是從純化的凝膠中回收瓊脂糖塊，熔化后直接進行質粒和外源DNA的連接。這一方法尋平端連接和粘端連接都同樣奏效，但需大量的連接酶，而且效率要比標準操作方案約低一個數量級。

1）用適當的限制酶消化外源DNA，其量應足以產生約0.2μg的靶片段。反應體積應為20μl或更小。在另一管中，用相應的限制酶消化約0.5μg載體DNA，總反應體積為20μl或更小。如載體DNA帶相同的端，應用磷酸處理如下：用限制酶消化完全后，加2.5μl 100mmol/L (pH8.3)、10mmol/L ZnCl2,加0.25單位牛小腸鹼性磷酸酶，於37℃溫育30分鐘。

2）通過瓊脂糖凝膠電泳分離目標片段。務必用低熔點瓊脂糖灌制凝膠，務必用含溴化乙錠（0.5μg/ml）的1xTAE作為電泳緩衝液而不是常規的0.5xTBE來配製凝膠並進行電泳。

3）在長波長紫外照射下檢查凝膠，根據目標條帶的相對熒光強度估計所含DNA的量（見附錄E）。用刀片切出目標條帶，儘可能少瓊脂糖的體積（通常40-50μl)。將切下凝膠片分別放入作好標記的各個微量離心管中。

4）於70℃加熱10-15分釧，使瓊脂糖熔化。

5）合併熔化的小份凝膠並放到加溫至37℃的中一管中，共終體積應不超過10μl,外源DNA與質粒載體的摩爾比應接近2：1。

用另外兩個管設立兩個對照連反應，一個只含質粒載體，另一個只含外源DNA片段。

6）將3個管於37℃溫育5-10分鐘，然後每管加10μl用冰預次的2xT4噬體DNA連接酶混合物，在瓊脂糖凝固前，充他混勻各管內容物，於16℃溫育12-16小時。

2xT4噬菌體DNA連接酶混合物可製備如下：

1mol/L (pH7.6) 1.0μl

100mmol/L氯化鎂 1.0μl

200mmol/L三硫蘇糖醇 1.0μl

10mmol/L ATP 1.0μl

水 5.5μl

T4噬菌體DNA連接酶 1Weiss單位

混勻後放置於冰浴上。

7）連接反應行將結束時，取出貯存於-70的3管各200μl的凍存大腸桿菌感受態細胞

8）於70℃中熱10-15分鐘重新溶化連接混合物中的瓊脂糖。

9）立即從每管連接混全物中取出5μl加到200μl大腸桿菌感受態細胞中，小心搖晃，快速地混勻內容物。從剩下每管連接混合物中分別再取5μl重複以上步驟，將轉化混合物在冰浴上放置30分鐘。

10）完成轉化方案的其餘各步。