Annexin V
Annexin V
Annexin V是一種檢測細胞凋亡的試劑，在正常細胞中，磷脂醯絲氨酸只分佈在細胞膜脂質雙層的內側，細胞發生凋亡早期，膜磷脂醯絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。Annexin V作為一種磷脂結合蛋白，與磷脂醯絲氨酸有高度親和力，它通過細胞外側暴露的磷脂醯絲氨酸與凋亡早期細胞的胞膜結合。因此Annexin V是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。
細胞凋亡是細胞的基本特徵之一，它在機體的胚胎髮育、組織修復、內環境的穩定等方面起著十分重要的作用。在正常細胞中，磷脂醯絲氨酸（PS）只分佈在細胞膜脂質雙層的內側，而在細胞凋亡早期，細胞膜中的磷脂醯絲氨酸（PS）由脂膜內側翻向外側。AnnexinⅤ是一種分子量為35-36kD的 Ca依賴性磷脂結合蛋白，能與細胞凋亡過程中翻轉到膜外的PS高親和力特異性結合。
用標記了FITC的AnnexinⅤ作為熒光探針，利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡的發生，正常細胞和早期凋亡細胞的細胞膜是完整的。Propidium iodide（PI）是一種核酸染料，它不能透過完整的細胞膜，但在凋亡中晚期的細胞和死細胞，PI能夠透過細胞膜與細胞核結合呈現紅色。將AnnexinⅤ與 PI匹配使用，可以將凋亡早期的細胞和晚期的細胞以及死細胞區分開來。
| 產品編號 | 401001 | 401002 | 401003 | 401004 |
| 規格 | 20 assays | 50 assays | 100 assays | 400 assays |
| Annexin V-FITC | 100μL | 250μL | 500μL | 2 mL |
| Propidium Iodide | 200μL | 500μL | 1 mL | 4 mL |
| 1X Binding Buffer | 8 mL | 20 mL | 40mL | 160mL |
Annexin V
用冷PBS洗滌細胞兩次；
在細胞懸浮液中加入5ul Annexin V-FITC，輕輕混勻後於2-8°C避光條件下孵育15分鐘。5. 加入10ul PI后輕輕混勻於2-8°C避光條件下孵育5分鐘；
在1小時內用流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。
經處理過的細胞此時可以在流式細胞儀上分析。
Annexin V相關圖片
1.上樣未經染色的細胞，在線性FS-SS點圖上顯示細胞並設門圈出目標細胞群體。
2.建立LogFL1-LogFL2（最好用FL3）雙參數點圖並分析以上光散射圖中設門的細胞；保證>98%的細胞處於在X、Y軸Log 1為邊界的左下象限中心區域。
3.檢測annexin V-FITC單染的細胞並檢查FL1-FL2（或FL3）散點圖，保證在左上和右上象限內沒有顆粒。如果有顆粒出現在上端象限則說明有熒光滲漏；此時FL1的熒光被FL2 （或FL3）PMT檢測到了。為了糾正這種現象，增加FL1漏到FL2（或FL3）熒光的補償%（這可能在1-5%之間）。如果這個調節沒有有效地去除FL2的陽性信號，此時要降低FL2（或FL3） PMT的電壓。
4.檢測PI單染的細胞並檢查FL1-FL2（或FL3）散點圖，保證在右上和右下象限內沒有顆粒。如果有顆粒出現在右側象限則說明有熒光滲漏；此時PI的熒光被FL1 PMT檢測到了。為了糾正這種現象，增加FL2（或FL3）漏到FL1熒光的補償%（這可能在15-25%之間）。如果這個調節沒有有效地去除FL1的陽性信號，此時要降低FL1 PMT的電壓。
註：如果在以上調節補償過程中更改了PMT的電壓，建議重複 3、4步驟，確保不引起過度熒光補償。過度補償可以從陽性細胞十分貼近從標這一現象觀察出來。一個恰當的補償應該是單陽性細胞熒光強度與落在左下Log 1為邊界象限中間陰性細胞的熒光強度一致。
5.設定十字門的位置，FL1和FL2（或FL3）的劃定方法如下：
5.1設定FL1標尺位置: 處於左下象限內的大群細胞是Annexin V染色陰性的細胞（一般這些細胞會在FL1軸方向上升至2個對數坐標值）。將垂直的FL1標尺設定在緊靠Annexin V陰性群體右側0.1-0.2Log單位的地方。
5.2 設定FL2 （或FL3）標尺位置: 可以通過一定數據的雙陽性細胞來區分PI+和PI-的細胞群體。在此條件下可能會識別出兩群細胞，一是位於散點圖的右下方（ANN+/PI-）還有就是右上方（ANN+/PI+）。水平線可以置於這兩群細胞的中間。如果在分析的細胞群體中沒有PI+細胞，區分PI+細胞最好是參照雙陰性細胞群體，將水平線設在雙陰性細胞以上0.1-0.3 Log單位的地方。
註：在陰性群體門以外的細胞可被識為Annexin V或Annexin V和PI陽性的細胞。
熒光顯微鏡觀察：
註：對於貼壁細胞，可直接用蓋玻片培養細胞並誘導細胞凋亡。
在熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察。Annexin V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。
2-8℃保存。
一年。
1.旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。
2.細胞處理需要小心操作，盡量避免人為的損傷細胞。
3.Annexin V-FITC和Propidium iodide是光敏物質，在操作時請注意避光。
4.成功的檢測凋亡受以下幾種因素的影響，如細胞類型、細胞膜上PS的密度、發生凋亡時PS翻轉的比例、誘導細胞凋亡的方法、所用試劑、誘導凋亡的時間等，把這些影響因素進行優化對實驗成功與否至關重要。