體外受精

自然界體外受精的生物包括魚類與兩棲類，是指精子與卵子在雌性生物體外結合產生受精卵的受精方式。這種受精形式一般在水中完成。精子可利用在水中運動的能力，游向卵子並與其結合。

20世紀60年代初至20世紀80年代中期，人們以家兔、小鼠和大鼠等為實驗材料，進行了大量 基礎研究，在精子獲能機理和獲能方法方面取得很大進展。精子由最初在同種或異種雌性生殖道孵育獲能，發展到用子宮液、卵泡液、子宮內膜提取液或血清等在體外培養獲能，最後用化學成分明確的溶液培養獲能。同時，通過射出精子和附睾精子獲能效果的比較研究，人們發現射出精液中含有去能因子，並認識到獲能的實質是去除精子表面的去能因子。這些理論和方法上的成就，推動了體外受精技術的發展，試管小鼠（Whit-tingham，1968）、大鼠（Toyoda和Chang，1974）、嬰兒（Steptoe和Edwards，1978）、牛(Brackett等，1982）、山羊(Hamda，1985）、綿羊(Hanada，1985）和豬(Chang等，1986）等相繼出生。

20世紀80年代中期以後，以牛為代表的家畜ⅣF技術發展迅速，1987年Parrish等用含肝素的介質處理牛的冷凍精液，然後與體外成熟的卵母細胞體外受精獲得成功。這對牛ⅣF的研究和應用具有重要意義，因為這種方法可利用屠宰場廢棄的卵巢和冷凍精液進行胚胎體外生產，不僅成本低廉，而且效果穩定。此後，牛的卵母細胞體外成熟和胚胎培養體系逐步趨於成熟，胚胎體外生產效率得到很大提高。目前，採用ⅣF_ET技術，每對廢棄的牛卵巢可獲得3頭左右的犢牛。為充分利用良種母牛的遺傳資源，20世紀80年代後期，牛的活體取卵技術（Ovum pick UP.OPU）發展迅速。活體取卵和ⅣF_ET結合已成為歐、美和大洋洲等畜牧業發達國家的農場主為擴大良種母牛群選擇的重要繁殖技術。

牛的體外受精技術不僅應用於畜牧生產，同時，也成為研究其他胚胎生物技術，如克隆、轉基因、胚胎幹細胞分離培養和性別控制等的重要輔助手段。

體外受精能懷孕嗎

在不孕症治療中，體外受精技術是與胚胎移植技術相關聯的。就是說當受精卵在人工孵育的條件下經過分裂，達到8至16個卵裂細胞時，再用人工方法移入分泌期的婦女子宮內，使孕卵著床。體外受精和胚胎移植技術的結合，就是人們通俗說的“試管嬰兒”技術，隨著科學的發展，這一技術在不孕症治療中將發揮更大作用。

所謂協助性體外受精，就是將精子或卵子取出體外，經過處理或培養成胚胎后，再植入人體內，克服傳統治療的障礙，其中大家最熟悉的治療就是試管嬰兒。實際上最簡單的精子洗滌合併子宮的體外授精術也是體外受精的一種，對於輕度的不孕症疾病，例如輕度的精子活動力差，夫妻體內的抗精子抗體的自體免疫疾病，子宮頸的疾病，性交與射精障礙者，施以體外授精治療每次有20%的懷孕率。

1．卵母細胞的採集：卵母細胞的採集方法通常有三種。

⑴超數排卵：對於實驗動物如小鼠、兔，以及家畜豬、羊等採用的主要方法是；用促性腺激素處理，使其排出更多的卵子，然後，從輸卵管中沖取成熟卵子可直接與獲能精子受精。在大家畜中，由於操作程序複雜，成本較高，很少使用。這種方法的關鍵是掌握卵子進入輸卵管和卵子在輸卵管中維持受精能力的時間，一般要求在卵子具有旺盛受精力之前沖取。

⑵從活體卵巢中採集卵母細胞：這種方法是藉助超聲波探測儀、內窺鏡或腹腔鏡直接從活體動物的卵巢中吸取卵母細胞。

在家畜中，牛和馬等大家畜常用超聲波探測儀輔助取卵，其方法是用手從直腸把握卵巢，經陰道壁穿刺插入吸卵針，藉助B型超聲波圖像引導，吸取大卵泡中的卵母細胞。按照目前的技術水平，一頭健康母牛每周可獲得5~10枚卵子。在家畜中，活體採集的卵母細胞一般要經成熟培養后才能與精子受精。這種方法對擴繁優良母畜具有重大意義，在有些國家已用於商業化生產。

⑶從屠宰後母畜卵巢上採集卵母細胞：這種方法是從剛屠宰母畜體內摘出卵巢，經洗滌、保溫（30℃~37℃）后，快速運到實驗室，在無菌條件下用注射器或真空泵抽吸卵巢表面一定直徑卵泡中的卵母細胞（牛卵泡直徑要求3-10mm）也可對卵巢進行切片，收集卵母細胞。用此方法獲得的卵母細胞多數處於生髮泡期（GV期），需要在體外培養成熟后才能與精子受精。從廢棄卵巢中採集卵母細胞的關鍵是注意卵巢的保溫和防止細菌污染。因此卵巢從畜體摘取后須放入含有生理鹽水或磷酸緩衝液（PBS）的保溫瓶中；吸卵前卵巢要用生理鹽水或PBS多次洗滌；所用溶液都要添加抗生素。

這種方法的最大優點是材料來源豐富，成本低廉，但確定母畜的系譜困難。

2．母細胞的選擇：採集的卵母細胞絕大部分與卵丘細胞形成卵丘卵母細胞複合體（cumulus oocyte complesx COC）。無論採用何種方法，採集的COC都要求卵母細胞形態規則，細胞質均勻，外圍有多層卵丘細胞緊密包圍。在家畜體外受精研究中，常把未成熟卵母細胞分為A、B、C和D四個等級。A級卵母細胞要求有三層以上卵丘細胞緊密包圍，細胞質均勻；B級要求卵母細胞質均勻，卵丘細胞層低於三層或部分包圍卵母細胞；C級為沒有卵丘細胞包圍的裸露卵母細胞；D級是死亡或退化的卵母細胞。在體外受精實踐中，一般只培養A級和B級卵母細胞。

3．卵母細胞的成熟培養：由超數排卵採集的卵母細胞已在體內發育成熟，不需培養可直接與精子受精，對未成熟卵母細胞需要在體外培養成熟。培養時，先將採集的卵母細胞在實體顯微鏡經過挑選和洗滌后，然後放入成熟培養液中培養。家畜卵母細胞的成熟培養液目前普遍採用TCM199添加孕牛血清、促性腺激素、雌激素和抗生素成份。通常採用微滴培養法，微滴體積為50-200微升，每滴中放入的卵母細胞數按每5微升一個計算單位。卵母細胞移入小滴后，放入二氧化碳培養箱中培養，培養條件為39℃、100%濕度和5%二氧化碳的空氣。牛的培養時間為20-24小時，卵丘卵母細胞複合體經成熟培養后，卵丘細胞層擴散靠近卵母細胞周圍的卵丘細胞呈放射狀排列，出現放射冠，用DNA特意性染料染色后，在顯微鏡下進行核相觀察，可見卵母細胞處於第2次成熟分裂中期。

● ● 假陰道法

● ● 手握法

● ● 電刺激法

徠1．精子的獲能處理：哺乳動物精子的獲能方法有培養和化學誘導兩種方法。牛、羊的精子常用化學藥物誘導獲能，誘導獲能的藥物常用肝素和鈣離子載體。

2．受精：即獲能精子與成熟卵子的共培養，除鈣離子載體誘導獲能外，精子和卵子一般在獲能液中完成受精過程。受精培養時間與獲能方法有關。在B2液中一般為6-8小時而用TALP或S.F液作受精液時可培養18~24h。精子和卵子常在小滴中共培養，受精時精子密度為1~9×10 6/ml，每10微升精液中放人1~2枚卵子，小滴體積一般為50~200微升。

精子和卵子受精后，受精卵需移入發育培養液中繼續培養以檢查受精狀況和受精卵的發育潛力，質量較好的胚胎可移入受體母畜的生殖道內繼續發育成熟或進行冷凍保存。

提高受精卵發育率的關鍵因素是選擇理想的培養體系。在家畜中，胚胎培養液分為複雜的和化學成分明確的培養液兩大類。複雜培養液中的成分很多，除無機和有機鹽外，還添加維生素、氨基酸、核苷酸和嘌呤等營養成分和血清，最常用的有TCM199、B2和F10。用它們培養胚胎時，可以採用體細胞共培養體系，即體細胞與胚胎在微滴中共同培養，利用體細胞生長過程中分泌的有益因子，促進胚胎髮育，克服發育阻斷。

受精卵的培養廣泛採用微滴法，胚胎與培養液的比例為一枚胚胎用3~10微升培養液；一般5~10枚胚胎放在一個小滴中培養以利用胚胎在生長過程中分泌的活性因子，相互促進發育。胚胎培養條件與卵母細胞成熟培養條件相同。有的實驗室採用88% N2、7% O2和5%二氧化碳混合氣體培養，以降低培養液中氧自由基濃度，提高胚胎髮育率。胚胎在培養過程中要求每48-72小時更換一次培養液，同時觀察胚胎的發育狀況。當胚胎髮育到一定階段時可進行胚胎移植或冷凍保存，牛、羊受精卵通常培養到緻密桑椹胚或囊胚時進行移植或冷凍保存。

家畜體外受精技術經過近20年的發展，已取得很大進展，其中牛的ⅣF水平最高，入孵卵母細胞（即進入成熟培養）的卵裂率為80%~90%，受精后第七天的囊胚發育率為40%~50%，囊胚超低溫冷凍後繼續發育率為80%，移植后的產犢率為30%~40%.平均每個卵巢可獲得A級卵母細胞10個左右，經體外受精可獲得3~4個囊胚，移植后產犢1~2頭。

⑴囊胚發育率低，細胞數少。體外受精卵在培養過程中普遍存在發育阻斷(developmental

block），即胚胎髮育到一定階段后停止發育併發生退化的現象。牛胚胎阻斷髮生在8~16細胞階段，這就導致體外受精卵的囊胚發育率遠低於體內受精。此外，與體內受精囊胚相比，體外受精囊胚的細胞總數和內細胞團細胞數明顯減少。

⑵產犢率低，胎兒初生重高。家畜體外受精胚胎，特別是牛的IVF胚胎移入受體后，產犢率比體內受精低15%~20%，但胎兒初生重比體內受精後代高3~4kg，導致受體母畜難產率高。

⑴深入研究卵母細胞成熟和胚胎髮育的分子機理 體外受精效率低的主要原因是人

們對卵子發生和胚胎髮育的分子機理了解不夠。大幅度提高ⅣF效率的前提是探明卵母細胞和早期胚胎髮育的分子調控機理，然後以此理論為指導，研究理想的培養體系，促使胚胎基因組得到穩定、有序表達.

⑵加強腔前卵泡培養的研究，利用優良母畜的遺傳資源 目前ⅣF技術利用的卵母細胞不足家畜卵巢上卵母細胞總數的千分之一。為此，一方面提高活體取卵技術，另一方面需研究腔前卵泡和小卵泡的體外成熟技術。為保證卵母細胞的穩定來源及良種母畜或瀕危動物的保種，卵泡和卵母細胞的超低溫冷凍保存技術的研究也必須加強。

⑶加強體外受精與其他生物技術的結合。體外受精與轉基因、克隆、性別控制及胚胎幹細胞的培養密不可分。通過體外受精可為外源基因的導人提供充足的胚胎來源；為克隆技術提供成熟卵母細胞和克隆胚胎的培養體系；用分離的X和Y精子與卵子體外受精，可對哺乳動物進行性別控制。同樣，胚胎幹細胞的分離也需要ⅣF技術提供胚胎和培養體系。這些生物技術的綜合發展將對人類生活產生重大影響。