熒光技術

光照射物質時，光子打到分子上，大約在10-15秒內被吸收，原來處於基態的電子被激發到較高的能級，從而使分子處在激發態。此後，激發態分子通過內轉換過程把部分能量轉移給周圍分子，使較高激發態的電子很快回到最低激發態的最低振動能級（亦稱第一單線態）。處在第一單線態的分子的平均壽命是10^-8秒左右。如果這種分子通過發射出相應的光子而回到基態的各個不同的振動能級，即可產生熒光，根據回到的振動能級的不同，熒光的波長就不同，從而形成熒光發射帶光譜。由於發射熒光前已有一部分能量被消耗，所以發射熒光所相應的能量要比物質吸收的光能量小，故而熒光的發射特徵波長總比激發特徵波長長。

物質能否產生熒光，主要和物質本身的結構及周圍介質環境（如溶劑極性、pH值、溫度等）有關。

固定發射波長，用不同波長的激發光激發樣品，記錄下相應的熒光發射強度，即得激發光譜。

固定激發波長，記錄在不同波長所發射的熒光的相對強度，即得發射光譜。

熒光的相對強弱，與很多因素有關，可用（1）式表示：式中F表示熒光強度，K是儀器常數，Φ為熒光量子產率，是激發光強度；ε是樣品的克分子消光係數；b為樣品池的光徑長度；c為樣品濃度。當濃度很稀時（1）式可近似為（2）式：

從此式可知，在低濃度等件下，樣品濃度和熒光強度呈線性關係。

量子產率一般用Φ表示，其定義如（3）式所示：

用τ表示熒光壽命，並以（4）式定義之： （4）

該式表達了熒光物質被一瞬時光脈衝激發產生的熒光隨時間的衰減。熒光壽命τ就是熒光強度下降到最大熒光強度F0的1/e時所需要的時間。

熒光偏振常用偏振度表示，其定義如（5）式：

式中F∥表示激發光起偏器和熒光檢偏器的透射軸方向平行時測得的熒光強度；F⊥是上述兩方向互相垂直時的熒光強度。當時，說明完全不偏振；P在-1至+1之間即為部分偏振。

熒光技術在生物化學及分子生物學研究中應用主要包括以下幾個方面：

1、物質的定性：不同的熒光物質有不同的激發光譜和發射光譜，因此可用熒光進行物質的鑒別。與吸收光譜法相比，熒光法具有更高的選擇性。

2、定量測定：利用在較低濃度下熒光強度與樣品濃度成正比這一關係可以定量分析樣品中熒光組分的含量，常用於測定氨基酸、蛋白質、核酸的含量。熒光定量測定的一個優點是靈敏度高，例如維生素B2的測定限量可達1毫微克/毫升，這一優點使測定時所需要樣品量大大減少。

這種定量測定方法還可應用於酶催化的反應，只要反應前後有熒光強度的變化，就可用來測定酶的含量及酶反應的速率等。

3、研究生物大分子的物理化學特性及其分子的結構和構象：熒光的激發光譜、發射光譜、量子產率和熒光壽命等參數不僅和分子內熒光發色基團的本身結構有關，而且還強烈地依賴於發色團周圍的環境，即對周圍環境十分敏感。利用此特點可通過測定上述有關熒光參數的變化來研究熒光發色團所在部位的微環境的特徵及其變化。在此研究中，除了利用生物大分子本身具有的熒光發色團（如色氨酸、酪氨酸、鳥苷酸等，此類熒光稱為內源熒光）以外，可將一些特殊的熒光染料分子共價地結合或吸附在生物大分子的某一部位，通過測定該染料分子的熒光特性變化來研究生物大分子，這種染料分子被稱為“熒光探針”，它們發出的熒光一般稱為外源熒光。熒光探針的應用，大大地開拓了熒光技術在分子生物學中的應用範圍。

4、利用熒光壽命、量子產率等參數可以研究生物大分子中的能量轉移現象：通過該現象的研究，可以獲得生物大分子內部的許多信息，如分子內兩熒光基團D, A之間的臨界距離可根據弗爾斯特公式來測定，弗爾斯特(Förster)公式如（6）式所示：

即是兩熒光發色團之間的能量傳遞的速率KDA和它們之間的臨界距離Ro的六次方成反比。式中的KDA、K、J等均可由熒光壽命、量子產率及熒光強度的測定來推算，從而可以得知兩基團之間的距離。

以往人們常用熒光偏振做指標來研究生物大分子動力學。近年來人們趨於用熒光偏振隨時間的衰減來研究這些問題。在這種方法中，激發光不是一連續的 面偏振光，而是一偏振的光脈衝，因此測得的F∥和F是在兩個不同方向上偏振的熒光隨時間的衰減，它既和熒光壽命τ有關，又與分子在溶液中的運動有關，因此常表示為和 。由它們可得一相當重要的物理量——各向異性參數A（t）。

由A（t）可推測生物大分子的形狀、分子轉動弛豫時間（即從一個定向的狀態到一個無定向狀態所要的時間），進而可以推知生物大分子的大小、分子在溶液中的轉動角度和時間之間的函數關係。由這些結果可以研究分子之間的相互作用、分子間結合的緊密程度、蛋白質、核酸分子的解聚程度等等。

另外，熒光技術在免疫學中亦有廣泛的應用。最重要的就是熒光抗體法。將某些熒光染料與血清抗體相結合，這種標記的抗體仍可專一地與相應抗原發生結合，形成的複合體具有熒光特性，從而可以確定抗原或抗體的存在及其含量。

5、在醫療診斷中的應用之DNA測序熒光染料： DNA序列的破譯是新世紀基因工程研究的重要前提。近年來，DNA測序的新技術、新方法不斷湧現，熒光染料標記DNA的基因晶元技術使其中最引人注目的。在熒光染料標記DNA測序技術中所用的熒光染料要求是：吸收光譜應在可見光區發射，光譜盡量靠近紅光區，以避免DNA自身的藍色熒光干擾；能發射足夠強度的熒光；不影響DNA片段在電場中的泳動；染料本身無毒害。

目前用於DNA序列的熒光染料主要是咕噸類化合物、菁類化合物、1,8-萘醯亞胺類染料以及二吡咯烷硼二氟類染料，熒光多為黃、綠、紅色，熒光量子產率較高。

6、熒光技術在醫療診斷中的應用之光動力治療用色素：將特定的光敏感材料注入體內，它富集在腫瘤組織內，在正常細胞組織被代謝排除體外。用適當的光激發，可以檢測出癌症病處，再用特定波長的激光激發，產生能破壞腫瘤組織的自由基物質或引發氧分子轉變為能殺滅癌細胞的單線態氧，達到治療的目的。

光動力療法是除手術、化療和放射療法之外的第四種治療腫瘤的方法。它副作用小，不會引起外貌損傷。由於光動力療法具有高度的選擇性，破壞腫瘤組織目前臨床使用的光敏化材料多為卟啉類化合物。由於光動力療法的優異性能，目前已成為世界各國的研究熱點。

熒光技術中應用的主要儀器有熒光分光光度計和毫微秒熒光計。

該儀器的基本結構主要由激發光源（常用氙燈）、激發單色器、發射單色器、樣品池及檢測器（光電倍增管）等組成。和一般分光光度計不同，熒光檢測是在與激發光垂直方向上進行。結果的顯示方式有記錄儀、表頭、數字顯示、印表機等。一些高級熒光分光光度計還連有微處理機處理數據，可進行光譜積分、微分、本底扣除等。在熒光分光光度計的激發光路和發射光路中分別插入一塊偏振鏡，並使之可以旋轉，即可進行熒光偏振的測量。利用熒光分光光度計，可進行熒光激發光譜、發射光譜、量子產率、熒光強度等參數的測定。

根據工作原理的不同可分為毫微秒脈衝熒光計、位相式毫微秒熒光計，單光子計數毫微秒熒光計等。第一種儀器的原理如圖2示，用一持續時間極短的光脈衝（大約在毫微秒數量級，秒）激發熒光樣品，產生的熒光用快響應的光電倍增管或其他光電轉換器件轉換成電信號，在相應的示波器上顯示出熒光隨時間衰減的曲線，用計算機處理該曲線即可得到熒光壽命及其他有關參數。濾光片是用來選擇合適波長的激發光和熒光。偏振片用於測量各向異性常數A（t）。利用毫微秒熒光計可以測量熒光壽命、熒光偏振隨時間的衰減等參數。