電泳法

紙電泳法

操作法

(1) 電泳緩衝液:枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)。取枸櫞酸 (C6H8O7·H2O)39.04g與枸櫞酸鈉(C6H5Na3O7·2H2O4.12g，加水4000ml，使溶解。

(2) 濾紙:取色譜濾紙置1mol/L甲酸溶液中浸泡過夜，次日取出，用水漂洗至洗液的pH值不低於4,置60℃烘箱烘乾，備用。可按需要裁成長27cm、寬18cm的濾紙，或根據電泳室的大小裁剪，並在距長度方向一端5～8cm處劃一起始線，每隔2.5～3cm處做一記號備點樣用。

(3) 點樣：有濕點法和干點法。濕點法是將裁好的濾紙全部浸入枸櫞酸鹽緩衝液(pH3.0)中，濕潤后，取出，用濾紙吸干多餘的緩衝液，置電泳槽架上，使起始線靠近陰極端，將濾紙兩端浸入緩衝液中，然後用微量注射器精密點加供試品溶液，每10μl,共3點，並留2個空白位置；干點法是將供試品溶液點於濾紙上，吹乾、再點，反覆數次，直至點完規定量的供試品溶液，然後用噴霧器將濾紙噴濕，點樣處最後噴濕，本法適用於稀的供試品溶液。

(4) 電泳：於電泳槽中加入適量電泳緩衝液，浸沒鉑電極，接通電泳儀穩壓電源檔，調整電壓梯度為18～20V/cm，電泳約1小時45分鐘，取出，立即吹乾，置紫外光燈(254nm)下檢視，用鉛筆劃出紫色斑點的位置。

(5) 含量測定：剪下供試品斑點和與斑點位置面積相近的空白濾紙，剪成細條，分別置試管中，各精密加入0.01mol/L鹽酸溶液5ml，搖勻，放置1小時，用3號垂熔玻璃漏斗濾過，也可用自然沉降或離心法傾取上清液，按各藥品項下的規定測定吸收度，並按吸收係數計算含量。

醋酸纖維素薄膜電泳法

操作法

(1) 醋酸纖維素薄膜：取醋酸纖維素薄膜，裁成2cm×8cm的膜條，將無光澤面向下，浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中，待完全浸透，取出夾於濾紙中，輕輕吸去多餘的緩衝液后，將膜條無光澤面向上，置電泳槽架上，經濾紙橋浸入巴比妥緩衝液(pH8.6)中。

(2) 點樣與電泳：於膜條上距負極端2cm處，條狀滴加蛋白含量約5%的供試品溶液2～3μl,在10～12V/cm電位梯度下電泳。電泳區帶距離以4～5cm為宜。

(3) 染色：電泳完畢，將膜條取下浸於氨基黑染色液中，2～3分鐘后，用漂洗液浸洗數次，直至脫去底色止止。

(4) 透明：將洗凈並完全乾后的膜條浸於透明液中10～15分鐘，取出平鋪於潔凈的玻板上，干后即成透明薄膜，可於分光光度計上測定和作標本長期保存。

(5) 含量測定：未經透明處理的醋酸纖維素薄膜電泳圖可按各藥品項下規定的方法測定，一般採用洗脫法或掃描法，測定各蛋白質組分的相對含量(1%)。

瓊脂糖凝膠電泳法

操作法

(1)制膠：取瓊脂糖約0.2g，加水10ml，置水浴中加熱使溶脹完全，加溫熱的醋酸－鋰鹽緩衝液(pH3.0)10ml，混勻，趁熱將膠液塗佈於大小適宜(2.5cm×7.5cm或4cm×9cm)的玻板上，厚度約3mm，靜置，待凝膠結成無氣泡的均勻薄層，即得。

(2) 標準品溶液及供試品溶液的製備：照各藥品項下規定配製。

(3) 點樣與電泳：在電泳槽內加入醋酸－鋰鹽緩衝液(pH3.0),將凝膠板置於電泳槽架上，經濾紙橋浸入緩衝液。於凝膠板負極端分別點樣1μl，立即接通電源，在電壓梯度約30V/cm、電流強度1～2mA/cm的條件下，電泳約20分鐘，關閉電源。

(4) 染色與脫色：取下凝膠板，用甲苯胺藍溶液染色，用水洗去多餘的染色液至背景無色為止。

聚丙烯醯胺凝膠電泳法

操作法

(1)制膠：取溶液A2ml，溶液B5.4ml，加脲2.9g使溶解，再加水4ml，混勻，抽氣趕去溶液中氣泡，加0.56%過硫酸銨溶液2ml，混勻製成膠液，立即用裝有長針頭的注射器或細滴管將膠液沿管壁加至底端有橡皮塞的小玻璃管(10cm×0.5cm)中，使膠層高度達6～7cm, 然後徐徐滴加水少量，使覆蓋膠面，管底氣泡必須趕走，靜置約30分鐘，待出現明顯界面時即聚合完畢，吸去水層。

(2)標準品溶液及供試品溶液的製備：照各藥品項下的規定。

(3)電泳：將已制好的凝膠玻璃管裝入圓盤電泳槽內，每管加供試品或標準品溶液50～100μl，為防止擴散可加甘油或40%蔗糖溶液1～2滴及0.04%溴酚藍指示液1滴，也可直接在上槽緩衝液中加0.04%溴酚藍指示液數滴，玻璃管的上部用電極緩衝液充滿，上端接負極、下端接正極。調節起始電流使每管為1mA，數分鐘后，加大電流使每管為2～3mA，當溴酚藍指示液移至距玻璃管底部1cm處，關閉電源。

(4)染色和脫色:電泳完畢，用裝有長針頭並吸滿水的注射器，自膠管底部沿膠管壁將水壓入，膠條即從管內滑出，將膠條浸入稀染色液過夜或用染色液浸泡10～30分鐘，以水漂洗乾淨，再用脫色液脫色至無蛋白區帶凝膠的底色透明為止。

(5)結果判斷:將膠條置燈下觀察，根據供試品與標準品的色帶位置和色澤深淺程度進行判斷。將清晰的膠條置雙波長薄層掃描儀或凝膠電泳掃描儀中掃描並積分，由各組分的峰面積計算含量(1%)。

SDS-聚丙烯醯胺凝膠電泳法

操作法

(1)制膠:用30%丙烯醯胺溶液－分離膠緩衝液－20%十二烷基硫酸鈉溶液－10%過硫酸銨溶液（新鮮配製）-四甲基乙二胺-水(5.0∶1.5∶0.08∶0.1∶0.01∶5.3)製成分離膠液，灌入模具內至一定高度（剩餘體積留作製備濃縮膠用），用水封頂，聚合完畢，傾去水層。再用30%丙烯醯胺溶液-濃縮膠緩衝液-20%十二烷基硫酸鈉溶液-10%過硫酸銨溶液-四甲基乙二胺-水(0.8∶1.3∶0.025∶0.05∶0.005∶2.4)製成濃縮膠液，灌在分離膠上，插入樣品梳（如為圓盤電泳，用水封頂），待濃縮膠液聚合后，小心除去樣品梳或水。

(2)對照品和供試品溶液的製備:按照各藥品項下的規定。

(3)電泳,垂直板電泳：恆壓電泳，初始電壓為80V，進入分離膠時調至150～200V，當溴酚藍遷移膠底處，停止電泳。

(4)用卡尺或用掃描定位法測量溴酚藍指示劑和蛋白遷移距離（如為圓盤電泳還應測量染色前後膠條長度，垂直板電泳膠片厚度低於1mm，染色前後膠片長度基本不變）。計算相對遷移率：分子量 以R'<[m]>為橫坐標，標準蛋白的分子量對數為縱坐標，進行線性回歸，由標準曲線求得供試品的分子量.純度 取膠片（條），置薄層掃描儀，以峰面積按歸一化法計算；結果判斷供試品主成分遷移率應與對照品遷移率一致。

作用之一

緩衝液在電泳過程中的作用是維持合適的pH。電泳時的正極與負極都會發生電解反應，正極發生的是氧化反應，負極發生的是還原反應。長時間的電泳將使正極變酸，負極變鹼。一個好的緩衝系統應有較強的緩衝能力，使溶液兩極的pH保持基本不變。

作用之二

電泳緩衝液的另一個作用是使溶液具有一定的導電性，以利於DNA分子的遷移，例如，一般電泳緩衝液中應含有0.01-0.04mol/L的Na+離子，Na+離子的濃度太低時電泳速度變慢；太高時就會造成過大的電流使膠發熱甚至熔化。

其它作用

電泳緩衝液還有一個組分是EDTA（乙二胺四乙酸），加入濃度為1-2mmol/L，目的是螯合Mg2+ 等離子，防止電泳時激活 DNA酶，此外還可防止Mg2+離子與核酸生成沉澱。

此外，我們常常用“電泳法”判斷液體的性質，是膠體還是溶液。在高中化學中我們就用過這種方法判斷給定的液體是否為膠體。

2010版中國藥典修訂增訂內容

附錄VF電泳法

[增訂]

第六法 等電聚焦水平板電泳法

兩性電解質在電泳場中形成一個pH梯度，由於蛋白質為兩性化合物，其所帶的電荷與介質的pH值有關，帶電的蛋白質在電泳中向極性相反的方向遷移，當到達其等電點（此處的pH值使相應的蛋白質不再帶電荷）時，電流達到最小，不再移動。本法用於檢測蛋白類和肽類供試品的等電點。除另有規定外按以下方法測定。

1. 儀器裝置恆壓或恆流電源、帶有冷卻裝置的水平電泳槽和制膠模具。

2. 試劑

（1）水（電阻率應不低於18MΩ·cm）

（2）A液：稱取丙烯醯胺5.0g，亞甲基雙丙烯醯胺0.15g，加適量水溶解，並稀釋至50ml，雙層濾紙濾過，避光保存。

（3）B液:10%硫酸銨溶液，新鮮配製。

（4）甲基紅試液:稱取5mg甲基紅，溶於10mL 0.05mol/L氫氧化鈉中。

（5）50%甘油

（6）正極液:0.5mol/L磷酸溶液

（7）負極液:1mol/L 氫氧化鈉溶液

3. 操作法

（1）制膠:取A液2.5ml，pH3~10的兩性電解質（或其它pH範圍的兩性電解質）0.35ml，水1.25ml，50%甘油0.5ml，抽氣5~10分鐘，加B液25μl，N,N,N’,N’-四甲基乙二胺6μl，混勻后緩慢的注入水平模具內，室溫下聚合。

（2）預電泳:將已聚合的聚丙烯醯胺凝膠放到冷卻板上，其間塗以液體石蠟或煤油並避免氣泡的產生。用正極液與負極液分別潤濕正極與負極電極條，然後分別放於陽極與陰極上，將電極對準電極條中心，加蓋，在恆壓法下進行測定，在起始電壓200V下預電泳30分鐘。

（3）對照品溶液和供試品溶液的製備:將供試品對水透析（或用其它方法）脫鹽，並將蛋白或多肽含量調節至0.5~5mg/ml（如供試品蛋白或多肽濃度太低，則需採用適當方法濃縮）。對照試品溶液統一供試品溶液製備。

（4）電泳:將加樣濾紙條以一定間隔置於凝膠上，加入供試品、對照品及等電點標準溶液5~20μl。選擇恆壓方式進行電泳，起始電壓為200V。電泳0.5~1小時待甲基紅遷出加樣條后，去除加樣條。調高電壓至400V，電泳至電流不再變化，再調高電壓至600V，待電流不再變化時停止電泳。

4. 固定和染色

（1）試劑

a. 固定液：20%三氯醋酸

b. 染色液：染色儲備液 稱取1.0gG-250，溶於20ml水中，為溶液1；稱取125g（NH4）2SO4，溶於400ml水中，為溶液2；稱取20gH3PO4，為溶液3；將溶液3加入到溶液1中，待G-250完全溶解后，與溶液2混合，並加水至1L，混勻后即得，用前應充分混合。

ii) 工作染色液：取60ml染色儲備液，與30ml甲醇混勻，徠新鮮配製。

c. 脫色液:蒸餾水

（2）固定與染色：電泳完畢后，取出膠片，置於固定液中固定20分鐘以上，取出膠片，置染色液中3小時，用脫色液脫色至背景透明后取出晾乾，亦可做成干膠永久保存。

5. 結果判斷

將膠片置凝膠電泳掃描儀中掃描，通過掃描定位法測量蛋白質或多肽與等電點標準的遷移距離。

（1）鑒別：供試品主成分遷移位置應與對照品遷移位置一致。

（2）等電點:以等電點標準試劑中各種蛋白的等電點（pI）對其相應的遷移距離直線回歸作圖；將供試品的遷移距離代入直線回歸方程，求出供試品的等電點。