Rho蛋白

Rho belongs to the Ras super family of low molecular weight GTPases. Fifteen Rho proteins have already been characterized and divided into three sub-families; the first includes Rho （A, B, C）, the second, Rnd 1-3 and the third which includes Rac 1-3, RhoG, Cdc42Hs, Rho/TTF. TC10 and Chp. Rho acts as a molecular switch which turns on of off various intracellular signaling pathways such as ACK, PAKs, MEKKs ROCK. Rho is active when bound to GTP and inactive when bound to GDP. It is also known to participate in many physiological activities including cell migration, adhesion, cytokinesis, proliferation, differentiation and apoptosis and to a greater extend cell transformation.

Rho家族蛋白是Ras超家族中最早被克隆出來的蛋白，它們是一組相對分子質量大約為20～25kD的三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）結合蛋白，具有GTP酶活性，因此，習慣被稱為Rho GTP酶，Rho GTP酶在細胞骨架重組調控方面起重要作用。近年來研究發現，Rho GTP酶在多種惡性腫瘤中高表達，並和腫瘤的發生、侵襲和轉移密切相關。本文主要從腫瘤細胞形態改變，細胞與胞外基質粘附以及細胞骨架重組等幾個方面，對Rho GTP酶作用於腫瘤侵襲轉移的分子調控機制綜述如下。

Rho GTP酶

到目前為止，Rho GTP酶超家族已發現約20個成員，根據結構和功能不同，大致分為5個亞家族，包括：（1）Rho亞家族，包括RhoA、RhoB和RhoC，在序列上具有高度同源性，並在多種細胞中高表達，主要參與張力纖維形成和粘著斑複合體（focal adhesion complexs，FACs）組裝；（2）Rac亞家族：包括Rac1、Rac2、Rac3和RhoG，促進層狀偽足和胞膜皺褶形成；（3）Cdc42亞家族，包括Cdc42、TC10、TCL、Wrch1和chp/Wrch2，其中Cdc42促進絲狀偽足形成；（4）Rnd亞家族：包括Rnd1、Rnd3/RhoE和Rnd2，在細胞中組成性激活表達並具有不同的組織分佈，可拮抗Rho信號通路；（5）Rho BTB亞家族，包括Rho BTB1和Rho BTB2，具體功能尚不清楚。在所有Rho GTP酶超家族成員中，Cdc42、Rac1和RhoA是目前研究最多的Rho GTP酶。Rho家族各成員在氨基酸序列上有50%～55%的同源性，在靠近催化位點處都有1個能和GTP結合的功能區，與催化GTP水解密切相關。Rho GTP酶同Ras超家族的其他成員一樣，羧基端通常具有共同結構域，即由半胱氨酸殘基，脂族殘基和其他氨基酸殘基組成的末端，是翻譯后修飾的位點。Rho GTP酶的翻譯后修飾與其質膜定位有關，只有經翻譯后修飾的Rho GTP酶才具有活性並能與細胞膜上適宜的脂質分子結合。在異戊烯基轉移酶的作用下，半胱氨酸的巰基和異戊二烯基團間共價形成硫醚鍵，並在內切酶的作用下水解掉末端其餘3個殘基，最後異戊二烯基化的半胱氨酸殘基在甲基轉移酶的作用下發生甲基化，完成翻譯后的修飾。Rho家族蛋白同Ras超家族的所有成員一樣在活性型/GTP限制型和失活型/二磷酸鳥苷（guanosine diphosphate，GDP）限制型構象之間循環。調節這個循環過程的3類重要蛋白是：（1）鳥苷酸交換因子（guaninenucleotide exchanging factors，GEFs），催化GDP的釋放和GTP的結合，活化Rho GTP酶。不同的Rho GEF在結構上都具有相同的功能域，包含1個DH（Dbl homology domain）區和1個PH（pleckstrin homologyv domain）區，前者與Rho GTP酶結合併催化其構象改變，後者通過和細胞膜上特定的脂質作用使GEF在膜上定位；（2）GTP酶活化蛋白（GTPase activating protein，GAP），作為負向調節因子加速Rho GTP酶的水解，使Rho GTP酶由活性狀態變為無活性狀態；（3）GDP解離抑制因子（GDP dissociation inhibitor，GDI），阻止GDP從Rho GTP酶上分離，抑制Rho GTP酶活性。Rho GTP酶是細胞內多條信號轉導通路的關鍵分子，作為分子開關在胞內信號轉導中發揮橋樑作用。Rho GTP酶可參與對正常細胞增殖、分化、凋亡的調節，並與腫瘤的發生和轉移密切相關。實驗研究發現，在多種腫瘤中可見Rho GTP酶表達異常，改變細胞內Rho GTP酶的表達水平可以直接影響腫瘤細胞侵襲和轉移的過程。

Rho GTP酶與腫瘤的侵襲轉移

腫瘤細胞在基質中的運動由4個循環往複的步驟組成，即頭部偽足的形成和延伸，新粘附位點的建立，胞體的收縮以及尾部的退縮，通過不斷重複的4個過程向前遷移。對這一過程精確調節的分子機制非常複雜，涉及胞內多條信號轉導通路。在多條信號級連反應通路中，Rho GTP酶尤其是RhoA、Rac1和Cdc42是關鍵的調控因子，主要參與對細胞形態改變，細胞與基質粘附及細胞骨架重組的調控，調節腫瘤細胞的侵襲轉移過程。

2.1 細胞形態改變

偽足形成和細胞形態改變是侵襲轉移的起始步驟。Rac可誘導質膜突起形成片狀樣的層狀偽足，而Cdc42誘導指頭樣突起的絲狀偽足形成。在高侵襲和轉移性的腫瘤細胞，還可見一種侵襲偽足形成，由於與細胞外基質降解密切相關，可能成為主要的偽足結構。層狀偽足與周圍基質形成粘附連接，產生細胞向前運動的錨著位點；絲狀偽足有助於細胞對周圍環境的適應及確定細胞遷移的方向。Wiskott Aldrich綜合征蛋白家族（Wiskott Aldrich syndrome protein，WASP）是調節細胞遷移的關鍵分子，包括神經組織來源WASP（neural Wiskott Aldrich syndrome protein，NWASP），WASP家族富含脯氨酸同源蛋白1（WASP family verprolin homologous protein1，WAVE1），WASP家族富含脯氨酸同源蛋白2（WASP family verprolin homologous protein2，WAVE2)等成員，也是Rac和Cdc42下游的重要效應子，在腫瘤細胞中高表達，Rac和Cdc42通過活化WASP家族成員誘導偽足形成和基質降解。Lorenz等首次使用熒光共振能量感測器區分活性狀態和失活狀態的NWASP構象，並模擬內源性NWASP功能發現，NWASP在遷移的腫瘤細胞頭部層狀偽足形成中起重要作用。細胞遷移頭部高度動態性偽足結構的形成依賴肌動蛋白單體聚合和肌動蛋白纖維的延長，WASP家族不同成員通過不同的結構域與Rac和Cdc42結合而活化，而肌動蛋白相關2/3複合體（actinrelated 2/3 complexs，Arp2/3 complexs）和肌動蛋白單體通過分別結合於活化的WASP家族羧基端共同的結構域，直接調控肌動蛋白單體聚合。Arp2/3複合體是肌動蛋白組裝的核心，可將肌動蛋白單體從頭合成組裝為肌動蛋白絲，進而促進絲狀偽足和層狀偽足的形成。Arp2/3複合體與WASP的結合是調控肌動蛋白聚合的重要因素，兩者在多種腫瘤細胞中共表達，對115例肺腺癌組織切片免疫組化染色發現，78例（678%）共表達Arp2/3和WAVE2，並與病人臨床生存時間負相關；多變數回歸分析揭示，Arp2/3和WAVE2的共表達是腫瘤複發的獨立危險因素。並且NWASP和Arp2/3複合體也是高侵襲和轉移性腫瘤細胞侵襲偽足形成的主要調節子，並可能成為腫瘤治療的重要靶位。肌動蛋白單體的聚合和偽足形成還依賴另一種關鍵調節子cofilin，cofilin可使肌動蛋白單體從肌動蛋白絲的頂端解離，誘導肌動蛋白絲從頭部折斷，產生新的末端。Rac和Cdc42可通過活化共同的底物p21激活激酶（p21 activated kinase，PAK），分別激活LIM（3種同源異型結構域蛋白lin11、isl1和mec3）激酶1（LIM kinase 1，LIMK1）和LIM激酶2（LIM kinase 2，LIMK 2），磷酸化cofilin使其失活而抑制肌動蛋白的解聚，穩定肌動蛋白細胞骨架。

2.2 細胞基質粘附

偽足形成啟動細胞遷移的過程，但細胞持續的遷移需依賴細胞偽足與細胞外基質（extracellular matrix，ECM）的穩定粘附，提供細胞向前遷移的牽引支點。遷移的細胞頭部與ECM的粘附和尾部與ECM的去粘附的不斷交替使得細胞向前遷移，Rho GTP酶對這一過程發揮精確的調節。細胞表面的整合素受體與ECM中特異的配體結合，通過整合素聚集成簇而形成FACs，而整合素受體的胞內區與樁蛋白（paxillin），紐蛋白（vinculin）和踝蛋白（talin）等多種肌動蛋白結合蛋白相互作用形成分子橋，並與細胞骨架相連，提供細胞遷移的錨著位點。活化的Rac可誘導肌動蛋白的聚合和層狀偽足的形成，同時也能誘導新的FACs的形成，而FACs的形成又能反過來活化Rac，這一正反饋的失控可增加腫瘤細胞的侵襲能力。Jung發現，活化的Rac1和Cdc42，可通過激活PAKl磷酸化下游的粘著斑激酶（focal adhesion kinase，FAK），活化的FAK作為分子支架招募胞漿中樁蛋白，紐蛋白和踝蛋白等至FACs，促進FACs的形成。p65激活激酶還可通過LIMK間接調節cofilin的活性，cofilin在活性型和失活型間的循環可調節肌動蛋白亞單位從肌動蛋白絲末端的解離和聚合，並對促進肌動蛋白纖維組裝時踏車（treadmilling）現象的發生非常必要。腫瘤細胞侵襲和轉移與ECM的降解密切相關，Rho GTP酶可直接或間接調節下游效應子促進ECM的降解。對人乳腺癌細胞株MDAMB435的研究發現，Rac1和Cdc42可通過間接活化LIMKl上調絲氨酸蛋白酶尿激酶型纖溶酶原激活劑（urokinase type plasminogen activator，uPA）系統，增加uPA啟動子活性，誘導uPA和uPA受體mRNA和蛋白表達及uPA的分泌，降解ECM膠原等成分，有助於細胞的侵襲轉移。

2.3細胞骨架重組

侵襲和轉移的腫瘤細胞的持續運動需依靠張力纖維收縮和肌動蛋白絲的延長提供動力，Rho GTP酶可通過調節細胞骨架的重組，為細胞遷移提供動力。張力纖維是真核細胞中一種穩定的、平行排列的微絲結構，由肌動蛋白、肌球蛋白、原肌球蛋白等組成，肌動肌球蛋白相對運動產生的收縮力是細胞遷移動力的主要來源。Rho及其下游的Rho相關捲曲螺旋形成蛋白激酶（Rho associated coiledcoil forming protein kinase，ROCK）可提升肌球蛋白輕鏈（myosin light chain，MLC）的磷酸化水平，增加肌動-肌球蛋白的收縮力促使細胞在ECM中的遷移。ROCK是Rho下游的重要效應分子，包括Rho激酶和p160 ROCK 2個成員。活化的ROCK通過2條通路提升MLC的磷酸化水平，一方面ROCK磷酸化其底物肌球蛋白輕鏈磷酸酶（myosin light chain phosphatase，MLCP）的肌球蛋白結合亞單位（myosin binding subunit，MBS）而抑制MLCP的磷酸酶活性，減少MLC磷酸基團的水解；另一方面，ROCK可直接磷酸化MLC，增加MLC的磷酸化水平，從而增加與肌動蛋白絲交聯產生的收縮力。抑制Rho/Rock通路能抑制腫瘤細胞張力纖維的收縮和細胞侵襲，顯性激活（dominant active）的p160 ROCK的質粒轉染的人卵巢癌細胞具有更強的侵襲和遷移能力，而用p160 ROCK的反義寡核苷酸處理的癌細胞侵襲和遷移能力可顯著減弱。Rho還可作用於下游另一重要效應分子mDia（Mammalian Diaphanousrelated protein）蛋白，活化的mDia蛋白可將肌動蛋白單體參入到肌動蛋白絲的末端，並阻止成帽蛋白的結合，誘導肌動蛋白絲的延長，有助於細胞遷移。

3、Rho GTP酶在腫瘤侵襲轉移診斷和治療中的意義

由於Rho GTP酶在許多惡性腫瘤中高表達，因此，Rho GTP酶可能成為腫瘤轉移的臨床診斷指標。對53例胃癌病人和7名胃腫瘤細胞株的Rho超家族7名主要成員RhoA、RhoB、RhoC、Rac1、Rac2、Rac3和Cdc42mRNA表達水平的檢測發現，RhoA、Rac1和Cdc42在胃癌組織切片中的平均表達水平顯著高於癌旁組織切片，RhoA的表達水平與腫瘤分期顯著正相關並和組織分化程度負相關，RhoA和Rac1在7種胃腫瘤細胞株中的mRNA表達水平，總蛋白量及活性都顯著高於正常胃粘膜上皮細胞株。RhoC在許多惡性腫瘤中高表達，特別是在轉移性腫瘤中表達異常增高。在原發胃癌細胞中RhoC的表達顯著高於正常胃上皮細胞，在有淋巴結轉移的原發胃癌中RhoC的表達顯著高於沒有淋巴結轉移的原發癌，在有多個淋巴結轉移的原發胃癌中RhoC的表達也顯著高於較少淋巴結轉移的胃癌細胞，穿過漿膜的胃癌細胞比在胃壁中的胃癌細胞具有更高的RhoC表達，表明RhoC的過表達與腫瘤細胞的高度浸潤相關，提示RhoC可作為胃癌病人臨床預后的重要指標。鑒於Rho GTP酶與腫瘤轉移的相關性，使其可能成為轉移性腫瘤臨床轉移及預後分析的重要指標。由於Rho GTP酶與腫瘤侵襲轉移密切相關，Rho GTP酶及其下游靶分子可能成為抑制腫瘤轉移的重要靶位。特異性的ROCK抑製劑Wf536可在體內抑制小鼠Lewis肺癌轉移及腫瘤細胞誘導的新生毛細血管生成，並在體外抑制腫瘤細胞在基質膠上的侵襲和遷移。由於Rho GTP酶翻譯后羧基端的修飾對於其正確的膜定位和活化非常重要，因此多種異戊烯基轉移酶抑製劑如Zarnestra，Sarasar，L778等，通過阻斷Rho GTP酶C端翻譯后修飾位點的蛋白質法呢基化，已被證實在腫瘤治療中有較好療效，而且針對某一種Rho GTP酶（如RhoA、RhoB、Rac1或Cdc42）的特異性異戊烯基轉移酶抑製劑將具有更好的臨床治療效果。由於針對Rho GTP酶進行的腫瘤治療能夠減少傳統抗癌藥物的副作用，因此Rho GTP酶已成為腫瘤藥物開發的新靶位，對於腫瘤的臨床治療將具有良好的應用前景。