小干擾RNA

siRNA最早是由英國的大衛·包孔博（David Baulcombe）團隊發現，是植物中的後轉錄基因沉默（post-transcriptional gene silencing；PTGS）現象的一部分，其研究結果發表於《科學》。2001年，湯瑪士·塗許爾（Thomas Tuschl）團隊發現合成的siRNA，可誘導哺乳動物體內的RNAi作用，結果發表於《科學》。這項發現引發了利用可控制的RNAi，來進行生物醫學研究與藥物開發的方法。

siRNA通常是一段長21個核苷酸的雙股RNA（dsRNA），其兩股分別在RNA的兩端超出另一端2個核苷酸，圖示如下：

每一股各有一個5'磷酸基末端與一個3'羥基末端。此結構是利用一種稱為dicer的酶處理而得，這種酶可以將較長的雙股RNA或小髮夾RNA（small hairpin RNA）切成siRNA。此外，siRNA也可經由多種不同轉染（transfection）技術導入細胞內，並對特定基因產生具專一性的敲弱（knockdown）效果。因此可利用經過適當剪裁的siRNA之互補性，來對已知序列的基因進行標定，這種現象使siRNA成為研究基因功能與藥物目標的一項重要工具。

小干擾RNA（siRNA），有時稱為短干擾RNA或沉默RNA，是一類雙鏈RNA分子，長度為20-25個鹼基對，類似於miRNA，並且在RNA干擾（RNAi）途徑內操作。它干擾了表達與互補的核苷酸序列的特定基因的轉錄后降解的mRNA，從而防止翻譯。

siRNA由雙鏈RNA (double strand RNA， dsRNA) 在細胞內被RNase III (如Dicer) 切割成21～25bp大小的雙鏈RNA。dsRNA可以是外源的， 如病毒RNA複製中間體或人工導入的dsRNA;也可以是內源的， 如細胞中單鏈RNA在RNA依賴的RNA聚合酶的作用下形成的dsRNA 。

1.長dsRNA（可來自髮夾，互補RNA和RNA依賴性RNA聚合酶）被稱為Dicer的內切核糖核酸酶切割。Dicer切割長dsRNA以形成短干擾RNA或siRNA;這使得分子能夠形成RNA誘導的沉默複合物（RISC）。

2.一旦siRNA進入細胞，它就會被整合到其他蛋白質中以形成RISC。

3.一旦siRNA是RISC複合物的一部分，siRNA就展開以形成單鏈siRNA。

4.由於其在5'末端的鹼基配對而在熱力學上較不穩定的鏈被選擇作為RISC複合物的一部分。

5.作為RISC複合物一部分的單鏈siRNA現在可以掃描並找到互補的mRNA

6.一旦單鏈siRNA（RISC複合物的一部分）與其靶mRNA結合，它就會誘導mRNA切割。

7.現在切割mRNA並被細胞識別為異常。這導致mRNA的降解，並且反過來不將mRNA翻譯成氨基酸然後轉化為蛋白質。從而沉默編碼該mRNA的基因。

siRNA也類似於miRNA，然而，miRNA來自較短的莖環RNA產物，通常通過抑制翻譯來沉默基因，並且具有更廣泛的作用特異性，而siRNA通常通過在翻譯前切割mRNA而起作用，並且具有100%的互補性，因此目標特異性非常嚴格。

通過轉染外源siRNA進行的基因敲低通常是不令人滿意的，因為該效應僅是短暫的，特別是在快速分裂的細胞中。這可以通過產生siRNA的表達載體來克服。修飾siRNA序列以在兩條鏈之間引入短環。得到的轉錄物是短髮夾RNA（shRNA），其可以通過Dicer以其通常的方式加工成功能性siRNA。典型的轉錄盒使用RNA聚合酶III啟動子（例如，U6或H1）來指導小核RNA（snRNA）的轉錄（U6參與基因剪接; H1是RNase）人RNase P）的成分。理論上，所得的siRNA轉錄物然後由Dicer處理。

通過使用細胞擠壓也可以提高基因敲低效率。

RNAi中siRNA的活性很大程度上取決於其與RNA誘導的沉默複合物（RISC）的結合能力。雙鏈體siRNA與RISC的結合之後是用內切核酸酶解開和切割有義鏈。然後剩餘的反義鏈-RISC複合物可以與靶mRNA結合以啟動轉錄沉默。

已經發現dsRNA還可以激活基因表達，這種機制被稱為“小RNA誘導的基因激活”或RNAa。已經顯示靶向基因啟動子的dsRNA誘導相關基因的有效轉錄激活。使用合成的dsRNA在人細胞中證明RNAa，稱為“小活化RNA”（saRNA）。目前尚不清楚RNAa是否在其他生物體中是保守的。

siRNA誘導的轉錄后基因沉默始於RNA誘導的沉默複合物（RISC）的組裝。該複合物通過切割編碼靶基因的mRNA分子來沉默某些基因表達。為了開始該過程，兩條siRNA鏈中的一條（引導鏈）將被裝載到RISC中，而另一條鏈即過客鏈被降解。某些Dicer酶可能負責將引導鏈載入到RISC中。然後，siRNA掃描並指導RISC到mRNA分子上完全互補的序列。認為mRNA分子的切割由RISC的Argonaute蛋白的Piwi結構域催化。然後通過切割與siRNA殘基10和11配對的靶核苷酸之間的磷酸二酯鍵精確切割mRNA分子，從5'端開始計數。這種切割導致mRNA片段被細胞核酸外切酶進一步降解。5'片段通過外來體從其3'末端降解，而3'片段從其5'末端通過5'-3'外切核糖核酸酶1（XRN1）降解。切割后靶mRNA鏈與RISC的解離允許更多的mRNA被沉默。這種解離過程很可能是由ATP水解驅動的外在因素促進的。

有時不會發生靶mRNA分子的切割。在一些情況下，磷酸二酯骨架的核酸內切裂解可以通過切割位點附近的siRNA和靶mRNA的錯配來抑制。其他時候，即使靶mRNA和siRNA完全配對，RISC的Argonaute蛋白也缺乏內切核酸酶活性。在這種情況下，基因表達將被miRNA誘導機制沉默。

Ping-Pong方法的簡化版本，涉及蛋白質Aubergine（Aub）和Argonaute-3（Ago3）切割piRNA的3'和5'末端。

Piwi相互作用的RNA負責轉座子的沉默，而不是siRNAs。

近年來，RNAi技術在病毒感染性疾病治療方面的應用已受到極大關注，尤其在AIDS、乙型肝炎和丙型肝炎等治療中的應用研究最為活躍。目前，在siRNA抗AIDS的研究中，針對HIV結構蛋白基因及長末端重複序列（longterminal repeat，LTR）的SiRNA可以控制病毒複製；針對宿主細胞HIV受體CD4基因的siRNA可有效控制病毒進入宿主細胞，抑制病毒的感染過程。但CD4是人體正常免疫功能不可缺少的分子，它的表達抑制勢必影響正常的免疫功能，由此設想針對CCR5、CCR4等共同受體設計siRNA，並正在試驗中。另外在抗病毒治療中，分別以丙型肝炎病毒、呼吸道合胞病毒、流感病毒、脊髓灰質炎病毒等基因組的編碼區或非編碼區為靶點設計的siRNA均取得了令人欣喜的體外抑制作用，但利用動物實驗模型驗證siRNA體內清除病毒的效果需進一步研究。 

雖然RNAi有望成為抗病毒治療的有效工具，但病毒株靶基因的高度突變或鹼基丟失，如HIV和流感病毒，成為設計siRNA時必須考慮的問題。另外一種稱為病毒抑制子蛋白的發現使研究人員對RNAi的抗病毒效應有了更深的認識，研究發現這種病毒抑制子由病毒基因組編碼產生，最初在植物中發現，目前有報道別的真核生物中也存在，其與RNA干擾裝置競爭性的結合，通過阻斷siRNA的加工或干擾信號的傳遞等途徑抑制RNA干擾，從而降低其抗病毒的效應。 

針對上述影響因素，在RNAi抗病毒的治療應用中，（1）靶序列的選擇最好是針對病毒的保守序列，以減少病毒變異的影響。（2）設計針對不同靶序列的多種SiRNA並聯合作用，以減少病毒逃逸的產生。（3）針對病毒進入細胞或病毒複製相關的宿主基因設計siRNA，如HIV受體CD4、CCR5等，這樣即使病毒高度變異，其逃逸RNA干擾的幾率也會大大降低。（4）針對病毒抑制子設計siRNA，可在一定程度上減少或避免病毒抑制子的產生，並且隨著對RNA干擾的深入研究，將會有越來越多的相關報道。綜上所述，RNAi在抗病毒治療應用方面雖取得很大的突破，但其應用於臨床還有待更深的研究。