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抗血清

一種含有多克隆抗體的血清

抗血清(antiserum)是一種含有多克隆抗體的血清。通過注射抗血清可以傳遞被動免疫(passive immunity)治療許多疾病。目前唯一能夠治療埃博拉病毒患者的方法就是通過注射前一個患者的抗血清到體內。

目錄

製備


1、動物的選擇
羊、馬、雞、猴、豚鼠,都是常用的免疫動物,在實驗中,選擇動物時應考慮抗原與動物的種屬關係、抗原性質與動物種類、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動物個體等因素。免疫用動物應選適齡、健壯.最好為雄性。最常用的實驗動物是家兔,一般選擇選擇年齡在6個月以上當年繁殖的♂性,體重2~3公斤,健康家兔三隻,免疫前用金屬編號牌固定兔耳,或用染料塗沫在動物的背部,作出明確的標記。
2、抗原製備
1)抗原稀釋:用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml,於免疫前一天加入溶液,使每毫升抗原溶液含青霉素1000 UI,鏈黴素1000UI,放4℃過夜(一般可不加青、鏈黴素)次日取出,與佐劑混合製成乳劑後用於動物免疫。
免疫原的注射劑量應考慮其抗原性的強弱、分子量大小、動物的個體狀態和免疫時間。對於純的可溶性抗原的免疫劑量,通常小鼠首次抗原劑量為50~100μg/次,大鼠為100~200μg/次,兔為100μg~1mg/次,合成免疫原為2 mg(半抗原約為20~200μg),一般需要與等量的福氏完全佐劑混合。加強免疫的劑量為首次計量的1/2,通常用不完全福氏佐劑或不用佐劑。如需製備高度特異性的抗血清,可選用低劑量抗原短程免疫法;反之,欲獲得高效價的抗血清,宜採用大劑量抗原長程免疫法。
2)佐劑和抗原乳劑的配製
1佐劑的配製:福氏完全佐劑(Freund’s complete adjuvant),各實驗室的配方不盡相同,我室採用的配方如下:
醫用液體石臘20毫升
羊毛脂12克
水浴溶化、混勻,分裝於青霉素小瓶,用紗布、線繩紮緊瓶塞。8磅20分鐘滅菌,4℃保存備用。於免疫前準備抗原乳劑製備時,以活卡介苗(有時亦用死卡介苗)代替死結核菌,每毫升試劑中加入10mg活卡,即為福氏完全佐劑。
2抗原乳劑的製備:其方法一般有兩種,其一,將等量的完全佐劑(注意佐劑必須預先加熱融化,但不超過50℃)和抗原溶液分別吸入兩個5ml注射器內,在兩個注射器的12#針頭間套上一根長約8~12cm的醫用無毒塑料管,將兩個注射器連接在一起(塑料管必須先經酒精浸泡消毒,使用時取出,用滅菌生理鹽水沖洗后,與注射器針頭相連接,塑料管與針頭的口徑須合適,不能松,稍緊些為宜),針頭插進塑料管約1~2cm然後由兩人相對而坐后緩緩推動針蕊,使管內溶液進入塑料管道至對側注射器內,每次推動針蕊時必須把管內容物全部推出,另一側也同樣操作,使管內液體往返混合,直至形成油包水乳劑(Water-in-oil enulsion)為止。
其二是,將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內,經過反覆碾磨,也可形成油包水乳劑,該法主要優點是快速,可靠,不足方面主要是由於粘附過多,浪費佐劑及抗原。
製成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果,因此,必須進行質量檢查,檢查的方法是將製成的乳劑滴一滴在涼水(自來水)表面,質量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散,不合格者進入水面后立即擴散,水面油亦逐漸擴大,這就必須要繼續操作至質量合格為止。
但有時,由於佐劑的配製質量原因,很難乳化至合格,遇有這種情況,須考慮重新配製佐劑。
3、免疫途徑,劑量和免疫周期
抗原注射途徑可根據不同抗原及試驗要求,選用皮內、皮下、肌肉、靜脈或淋巴結內等不同途徑注入抗原進行免疫。一般常採用背部、足掌·耳後等處皮內或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2~4周。常規免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫;再以免疫原加IFA作2~5次加強免疫,每次間隔2~3周,皮下或腹腔注射加強免疫。
1)常規(皮內多點注射)免疫:
1第一次免疫:劑量為每隻兔子注射1.0ml抗原乳劑(含抗原量1~2mg)。注射部位為兩隻後腳掌的皮內各注射0.2 ml,其餘0.6ml分多點注入脊柱二側,頸部,腹股溝和腋窩等處淋巴結附近部位皮內,每點可注入0.05ml,分12點注入。
2第二次免疫:初次免疫后20天左右,劑量為1.0ml/只(1~2mg/ml),加福氏不完全佐劑。注射部位在腹部皮下多點注射,每點注入0.1ml。
3第三次免疫:再次免疫后兩周內進行,注射劑量和部位同第二次免疫,免疫后7~14d抽取少許靜脈血,分離血清,試血測定效價。
2)淋巴結免疫:主要優點是可減少用量。過程如下:
1卡價苗致敏:免疫前足掌皮下每側各注入活卡價苗(75mg/ml)0.3ml。10天左右觀察兩側腘窩淋巴結,一般可腫脹如蠶豆大小,此時即可進行淋巴結內免疫注射。
2第一次免疫:用手指定淋巴結后在兩側腘窩淋巴結內各注入抗原乳劑0.25ml,每隻兔總量0.5ml;為加強免疫,於初次免疫20天後,於腹部皮下多點注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。
3二周后可如同第一次免疫的劑量和途徑再注射一次,一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價,效價如已達到要求可不必進行第三次免疫。
有條件的情況下,免疫后要加強動物飼料管理,如給熟黃豆飼養等。
3)腹腔免疫:一般不必加佐劑,適用於細胞性或顆粒性抗原,而且抗原性較強者,例如用綿羊紅細胞免疫家兔或小鼠即可用此法。
4、試血,測定抗體效價
一般在第三次免疫后7~10天即可於兔耳靜脈或小鼠尾尖取少量血,分離出血清之後進行試血。
①環狀試驗,較為經典的方法,目前較少採用,如與20μg/ml以下的抗原於30min內能出現“艹”的沉澱環,即測定抗體效價達1:5000以上時為合格。
②免疫雙擴散法,這是最常用的試血方法,其具體方法是,中間孔加稀釋的抗原(1mg/ml)10μl,周圍孔順時針方向加製備的抗血清分別為1:2,1:4,1:8,1:16,1:32和1:64,(用生理鹽水或PBS稀釋)。經37℃保溫24h后觀察結果,效價在1:16以上即可決定放血。
5、放血
經效價檢查合格后即可放血。放血前動物應停食12h,以減少血清中的脂肪含量。如擬保留該免疫動物,可直接由心臟取血,或切開耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血。取血後由靜脈緩緩注入等量5%葡萄溶液以補足失血量。取血的動物經2~3個月休息,可再次加強免疫后取血。如擬一次放血致死,可用頸動脈放血的方法,各種取血方法如下。
1)心臟取血:固定動物於仰卧位置,用食指探明心臟博動量高部位(在胸骨左側,由下向上數第3與第4助骨之間,指兔),剪去少許毛,用2.5%碘酒和75%酒精消毒后,以9#針頭在預定位置與胸部呈45。角刺入心臟,微微上下移動針頭,待見血液進入針筒后,即將注射器位置固定取血。2.5公斤體重的家兔一次可取血20~30ml。
2)耳緣靜脈滴血:先將耳緣靜脈附近的毛剪去用無菌棉球將皮膚擦乾淨(不用酒精消毒,避免溶血)。用檯燈照射耳部使血管因溫度增高而擴張,然後用無菌刀片將耳緣靜脈切一長0.5cm的縱切口,第一次切口應從耳尖部開始,以後再切時,逐步向耳根方向移動。用無菌試管或平皿收集流出的血液。如切口凝血,血流不暢時,可用無菌棉棒輕輕將切口外血凝塊擦去(注意勿使切口損傷太大),血流仍可繼續流出,直至達到所需要的血量為止。取血後用無菌棉球壓迫切口止血。耳緣靜脈取血一次可取血50ml左右而動物不死。
3)頸動脈放血:使動物仰卧固定四肢,頸部剪毛、消毒后縱向切開前頸部皮膚長約10cm,用止血鉗將皮膚分開夾住,剝離皮下組織,露出肌層,用刀柄加以分離,即見搏動的頸動脈。小心將頸動脈和迷走神經剝離長約5cm,選擇血管中段,用止血鉗夾住血管壁周圍的筋膜。遠心端用絲線結紮,近心端用動脈鉗夾住,用酒精棉花球消毒血管周圍,用無菌剪刀剪一V形缺口。取長2.5cm、直徑為1.6mm塑料管一段,將一端剪成針頭樣斜面,並將此端插入頸動脈中,另一端放入200ml無菌三角瓶內,然後放開止血鉗,血即流入三角瓶內,動物流血至死,2.5公斤家兔可放血80~100ml。
6、分離血清
必須在無菌條件下進行,待收集於平皿或三角瓶內的血液凝固之後,用無菌滴管在無菌環境(例如超凈工作台)中把血塊與瓶壁剝離后,放入37℃,1~2h取出後放入4℃過夜,使血清充分析出(不能冰凍,否則產生溶血),經離心沉澱分出血清,放進低溫冰箱保存。使用前必須經過簽定合格后再分裝保存備用。
7、抗血清的保存
1)經簽定合格后的抗血清,以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉,使其最後濃度分別為0.01%或0.05%。
2)用無菌滴管將抗血清分裝小管,每管裝1ml左右。
3)-20℃以下保存,可保存2年以上。
4)如有條件可將血清冷凍乾燥保存於4℃以下,保存時間更久