抗血清

1、動物的選擇

羊、馬、雞、猴、豚鼠，都是常用的免疫動物，在實驗中，選擇動物時應考慮抗原與動物的種屬關係、抗原性質與動物種類、免疫血清的需要量、免疫血清的要求以及動物個體等因素。免疫用動物應選適齡、健壯．最好為雄性。最常用的實驗動物是家兔，一般選擇選擇年齡在6個月以上當年繁殖的♂性，體重2～3公斤，健康家兔三隻，免疫前用金屬編號牌固定兔耳，或用染料塗沫在動物的背部，作出明確的標記。

2、抗原製備

1）抗原稀釋：用滅菌生理鹽水將抗原稀釋為2mg/ml，於免疫前一天加入溶液，使每毫升抗原溶液含青霉素1000 UI，鏈黴素1000UI，放4℃過夜（一般可不加青、鏈黴素）次日取出，與佐劑混合製成乳劑後用於動物免疫。

免疫原的注射劑量應考慮其抗原性的強弱、分子量大小、動物的個體狀態和免疫時間。對於純的可溶性抗原的免疫劑量，通常小鼠首次抗原劑量為50～100μg/次，大鼠為100～200μg/次，兔為100μg～1mg/次，合成免疫原為2 mg(半抗原約為20～200μg)，一般需要與等量的福氏完全佐劑混合。加強免疫的劑量為首次計量的1/2，通常用不完全福氏佐劑或不用佐劑。如需製備高度特異性的抗血清，可選用低劑量抗原短程免疫法；反之，欲獲得高效價的抗血清，宜採用大劑量抗原長程免疫法。

2）佐劑和抗原乳劑的配製

1佐劑的配製：福氏完全佐劑（Freund’s complete adjuvant），各實驗室的配方不盡相同，我室採用的配方如下：

醫用液體石臘20毫升

羊毛脂12克

水浴溶化、混勻，分裝於青霉素小瓶，用紗布、線繩紮緊瓶塞。8磅20分鐘滅菌，4℃保存備用。於免疫前準備抗原乳劑製備時，以活卡介苗（有時亦用死卡介苗）代替死結核菌，每毫升試劑中加入10mg活卡，即為福氏完全佐劑。

2抗原乳劑的製備：其方法一般有兩種，其一，將等量的完全佐劑（注意佐劑必須預先加熱融化，但不超過50℃）和抗原溶液分別吸入兩個5ml注射器內，在兩個注射器的12#針頭間套上一根長約8～12cm的醫用無毒塑料管，將兩個注射器連接在一起（塑料管必須先經酒精浸泡消毒，使用時取出，用滅菌生理鹽水沖洗后，與注射器針頭相連接，塑料管與針頭的口徑須合適，不能松，稍緊些為宜），針頭插進塑料管約1～2cm然後由兩人相對而坐后緩緩推動針蕊，使管內溶液進入塑料管道至對側注射器內，每次推動針蕊時必須把管內容物全部推出，另一側也同樣操作，使管內液體往返混合，直至形成油包水乳劑（Water-in-oil enulsion）為止。

其二是，將等量的佐劑和抗原溶液倒入缽內，經過反覆碾磨，也可形成油包水乳劑，該法主要優點是快速，可靠，不足方面主要是由於粘附過多，浪費佐劑及抗原。

製成的乳劑是否形成油包水乳劑直接影響免疫效果，因此，必須進行質量檢查，檢查的方法是將製成的乳劑滴一滴在涼水（自來水）表面，質量合格的乳劑滴入水面保持滴珠完整而不分散，不合格者進入水面后立即擴散，水面油亦逐漸擴大，這就必須要繼續操作至質量合格為止。

但有時，由於佐劑的配製質量原因，很難乳化至合格，遇有這種情況，須考慮重新配製佐劑。

3、免疫途徑，劑量和免疫周期

抗原注射途徑可根據不同抗原及試驗要求，選用皮內、皮下、肌肉、靜脈或淋巴結內等不同途徑注入抗原進行免疫。一般常採用背部、足掌·耳後等處皮內或皮下多點注射。初次免疫與第二次免疫的間隔時間多為2～4周。常規免疫方案為抗原加CFA皮下多點注射進行基礎免疫；再以免疫原加IFA作2～5次加強免疫，每次間隔2～3周，皮下或腹腔注射加強免疫。

1）常規（皮內多點注射）免疫：

1第一次免疫：劑量為每隻兔子注射1.0ml抗原乳劑（含抗原量1～2mg）。注射部位為兩隻後腳掌的皮內各注射0.2 ml，其餘0.6ml分多點注入脊柱二側，頸部，腹股溝和腋窩等處淋巴結附近部位皮內，每點可注入0.05ml，分12點注入。

2第二次免疫：初次免疫后20天左右，劑量為1.0ml/只（1～2mg/ml），加福氏不完全佐劑。注射部位在腹部皮下多點注射，每點注入0.1ml。

3第三次免疫：再次免疫后兩周內進行，注射劑量和部位同第二次免疫，免疫后7～14d抽取少許靜脈血，分離血清，試血測定效價。

2）淋巴結免疫：主要優點是可減少用量。過程如下：

1卡價苗致敏：免疫前足掌皮下每側各注入活卡價苗（75mg/ml）0.3ml。10天左右觀察兩側腘窩淋巴結，一般可腫脹如蠶豆大小，此時即可進行淋巴結內免疫注射。

2第一次免疫：用手指定淋巴結后在兩側腘窩淋巴結內各注入抗原乳劑0.25ml，每隻兔總量0.5ml；為加強免疫，於初次免疫20天後，於腹部皮下多點注射不加佐劑抗原溶液1mg/1ml。

3二周后可如同第一次免疫的劑量和途徑再注射一次，一般可在第三次免疫注射前試血滴定效價，效價如已達到要求可不必進行第三次免疫。

有條件的情況下，免疫后要加強動物飼料管理，如給熟黃豆飼養等。

3）腹腔免疫：一般不必加佐劑，適用於細胞性或顆粒性抗原，而且抗原性較強者，例如用綿羊紅細胞免疫家兔或小鼠即可用此法。

4、試血，測定抗體效價

一般在第三次免疫后7～10天即可於兔耳靜脈或小鼠尾尖取少量血，分離出血清之後進行試血。

①環狀試驗，較為經典的方法，目前較少採用，如與20μg/ml以下的抗原於30min內能出現“艹”的沉澱環，即測定抗體效價達1：5000以上時為合格。

②免疫雙擴散法，這是最常用的試血方法，其具體方法是，中間孔加稀釋的抗原（1mg/ml）10μl，周圍孔順時針方向加製備的抗血清分別為1:2,1:4,1:8，1:16，1:32和1:64，（用生理鹽水或PBS稀釋）。經37℃保溫24h后觀察結果，效價在1:16以上即可決定放血。

5、放血

經效價檢查合格后即可放血。放血前動物應停食12h，以減少血清中的脂肪含量。如擬保留該免疫動物，可直接由心臟取血，或切開耳緣靜脈滴血或心臟穿刺取血。取血後由靜脈緩緩注入等量5%葡萄溶液以補足失血量。取血的動物經2～3個月休息，可再次加強免疫后取血。如擬一次放血致死，可用頸動脈放血的方法，各種取血方法如下。

1）心臟取血：固定動物於仰卧位置，用食指探明心臟博動量高部位（在胸骨左側，由下向上數第3與第4助骨之間，指兔），剪去少許毛，用2.5%碘酒和75%酒精消毒后，以9#針頭在預定位置與胸部呈45。角刺入心臟，微微上下移動針頭，待見血液進入針筒后，即將注射器位置固定取血。2.5公斤體重的家兔一次可取血20～30ml。

2）耳緣靜脈滴血：先將耳緣靜脈附近的毛剪去用無菌棉球將皮膚擦乾淨（不用酒精消毒，避免溶血）。用檯燈照射耳部使血管因溫度增高而擴張，然後用無菌刀片將耳緣靜脈切一長0.5cm的縱切口，第一次切口應從耳尖部開始，以後再切時，逐步向耳根方向移動。用無菌試管或平皿收集流出的血液。如切口凝血，血流不暢時，可用無菌棉棒輕輕將切口外血凝塊擦去（注意勿使切口損傷太大），血流仍可繼續流出，直至達到所需要的血量為止。取血後用無菌棉球壓迫切口止血。耳緣靜脈取血一次可取血50ml左右而動物不死。

3）頸動脈放血：使動物仰卧固定四肢，頸部剪毛、消毒后縱向切開前頸部皮膚長約10cm，用止血鉗將皮膚分開夾住，剝離皮下組織，露出肌層，用刀柄加以分離，即見搏動的頸動脈。小心將頸動脈和迷走神經剝離長約5cm，選擇血管中段，用止血鉗夾住血管壁周圍的筋膜。遠心端用絲線結紮，近心端用動脈鉗夾住，用酒精棉花球消毒血管周圍，用無菌剪刀剪一V形缺口。取長2.5cm、直徑為1.6mm塑料管一段，將一端剪成針頭樣斜面，並將此端插入頸動脈中，另一端放入200ml無菌三角瓶內，然後放開止血鉗，血即流入三角瓶內，動物流血至死，2.5公斤家兔可放血80～100ml。

6、分離血清

必須在無菌條件下進行，待收集於平皿或三角瓶內的血液凝固之後，用無菌滴管在無菌環境（例如超凈工作台）中把血塊與瓶壁剝離后，放入37℃，1～2h取出後放入4℃過夜，使血清充分析出（不能冰凍，否則產生溶血），經離心沉澱分出血清，放進低溫冰箱保存。使用前必須經過簽定合格后再分裝保存備用。

7、抗血清的保存

1）經簽定合格后的抗血清，以1:100比例加入1%的硫柳汞或5%的疊氮鈉，使其最後濃度分別為0.01%或0.05%。

2）用無菌滴管將抗血清分裝小管，每管裝1ml左右。

3）-20℃以下保存，可保存2年以上。

4）如有條件可將血清冷凍乾燥保存於4℃以下，保存時間更久