反相色譜

反相液相色譜柱效高、分離能力強、保留機理清楚，是液相色譜分離模式中使用最為廣泛的一種，對於生物大分子、蛋白質及酶的分離分析，反相液相色譜正受到越來越多的關．反相色語法是以表面非極性載體為固定相，面以比固定相極性強的溶劑為流動相的—種液相色譜分離模式．反相色譜固定相大多是硅膠表面鍵合疏水基團，基於樣品中的不同組分和疏水基團之間疏水作用的不同而分離．在生物大分子分離中，多採用離子強度較低的酸件水溶液，添加一定量乙腈、異內醇或甲醇等與水互溶的有機溶劑作流動相．普通的反相色譜固定相和孔徑大於300Å的硅膠鍵合烷基固定相應用較為普遍，聚合物基質的反相色譜固定相也有較多應用．

反相色譜中樣品的保留值主要由固定相比表面積、鍵合相種類和濃度決定，保留值通常隨鏈長增長或鍵合相的疏水性增強而增大，對於非極性化合物通常遵循以下規則：(弱)非鍵合硅膠 << 氰基 < C1(TMS) < C3 < C4 < 苯基 < C8 ≈ C18(強)．溶質保留值與固定相表面積成正比，普通載體(80Å)的表面積約為250m/g，而300Å孔徑載體的比表面積約為60m/g。當其他條件相同時，溶質在300Å孔徑(低表面積)色譜柱上的保留值大約為80Å孔徑色譜柱上保留值的1/4(60：250)，小孔隙柱如高保留的C18柱或石墨碳柱有利於強親水性樣品洗脫．樣品的保留值也可以通過改變流動相組成或溶劑強度來調整，溶劑強度取決於有機溶劑的性質和其在流動相中的濃度．在反相色譜中，採用高溶劑強度、低極性的流動相時可獲得較低保留值．固定相的不同也可以導致選擇性發生變化，氰基、苯基、C8、C18等柱的選擇性有很大差異，一般應優先考慮C8、C18柱，然後是氰基柱，再次是苯基柱．

反相條件下，大多數蛋白質由於低PH、有機溶劑存在、溫度高於室溫和疏水鍵合相等綜合原因發生變性，這些化合物可能以兩種或兩種以上獨立或動態平衡的形式存在，它們通過色譜柱的保留速度不同，導致譜峰展寬、變形、甚至出現單一蛋白有多個峰的現象，部分變性也易使蛋白在柱上聚集，造成被洗脫蛋白的回收率低和鬼峰．反相色譜固定相表面烷基鏈長度對蛋白質的反相保留和蛋白質的活性回收有很大差異，烷基鏈越長(C8、C22、C30)，固定相疏水性越強，為使蛋白質等生物分子洗脫，流動相合機溶劑的含量較高，疏水性過強，會導致生物分子的不可逆吸附和生物活性損失，因此短鏈烷基固定相(C4、C8、苯基等)在生物大分子分離中表現出優勢。對多數小蛋白，在低pH乙腈/水梯度下，用C3~C8色譜柱分離，使蛋白完全展開並避免聚集或沉澱，能夠得到理想的分離結果．

在低pH流動相條件下進行分離，如(0.1% TFA適合於大多數樣品，10~25mmol/L磷酸對疏水性強的蛋白質更有利；以乙腈作有機溶劑，丙醇可能對疏水性強的蛋白質有利；柱溫50~80℃；將樣品溶於6mol/L尿素或鹽酸胍中(只可在室溫)進行預處理；用疏水性更強的鍵合相(長鏈與短鏈烷基鍵合相)；加兩性表面活件劑分離大分子和疏水性強的蛋白質等實驗條件有利於蛋白質樣品完全變性或儘可能降低變性。

1、吸光度。

乙腈HPLC級的小。乙腈和甲醇的市銷HPLC級和優級的吸收光譜中，乙腈HPLC吸收最小（特別是在短波長上小）。所謂HPLC級是除去具有吸收UV的雜質，在規定的波長上吸光度限制在規格值以內。在UV檢測時，產生的雜訊小，因此在進行UV短波長上的高靈敏度分析時乙腈HPLC級最適宜。另外，在UV檢測中的梯度基線上也是乙腈HPLC級產生鬼峰少，雖然，其他與水相溶性高的有機溶劑有各種各樣，但很難能找到比乙腈HPLC級吸收更小的。另外，甲醇的HPLC級和優級，雖然所得的光譜相差不大，但是優級不能保證吸光度，有可能產生偏差，價格也相差不大，所以盡量使用HPLC級。

2、壓力。

乙腈低，柱內承受的壓力，根據有機溶劑的種類或混合比率的不同而異，水/乙腈，水/甲醇混合液的比率與輸液壓力的關係中，甲醇與水混合，壓力增高，而乙腈同樣與水混合且並不如此。所以，乙腈一方，在同樣的流速下不在柱內加上多餘的壓力。從上述兩項，可以確認使用乙腈的意義，那麼，甲醇除了價格以外，還有沒有其化優點呢？

3、洗脫能力。

一般而言，乙腈較強。乙腈和甲醇分別用同樣的比率與水混合時，一般情況下，乙腈的洗脫能力強。特別是混合比率低時，從咖啡因和苯酚的洗脫來看，獲得同樣的保留時間，乙腈的比率，只需甲醇的比率的一半以下即可。另一方面，有機溶劑100%或與此極接近時，從胡蘿蔔素和膽甾醇來看，常常都是甲醇的洗脫能力強。混合比在50比1等較為特殊時，調製的誤差大，影響保留時間，或平衡化的時間長，乙腈遇到這種情況時，用甲醇的10比1混合代替乙腈，這樣操作方便些。溶劑受溫度影響時，不採用容器定量，而採用重量的方法（考慮比重），可使混合比的誤差減小。

4、分離（洗脫）的選擇性。

兩者的差異，乙腈和甲醇在分離的選擇性上不同。由於有機溶劑分子的化學性質（甲醇和乙醇是質子性，乙腈和四氫呋喃是非質子性）不同所致。因此，在用乙腈類不能獲得分離的選擇性，就試用甲醇類看看。

5、峰形。

用時出現差異。像水楊酸化合物（在鄰位上具有羧基或甲氧基的苯酚化合物）等，用乙腈類時拖尾大，用甲醇類可抑制。可是，一般情況下，聚合物類反相柱，與硅膠柱相比，更具有峰形寬的傾向，特別是用聚苯乙烯分析柱芳香族化合物等時常見。這在流動相是甲醇時非常顯著，而用乙腈時不明顯。為此，用聚合物類反相用柱時建議採用後者（乙腈類），這是因為乙腈使凝膠膨潤。

6、流動相的脫氣，乙腈類要注意。

混合溶劑的置制，不說在LC裝置內，只談預先在流動相瓶內進行時，（等濃度系統）。甲醇與水混合時發熱，多餘的溶解空氣較易變為脫出氣泡（脫氣容易）。而乙腈由於吸熱冷卻，隨著慢慢回到室溫，產生氣泡，所以要考慮脫氣（加溫攪拌，過濾膜，He脫氣等）。

7、結論

以上反相色譜法流動相常用的乙腈和甲醇進行了比較。粗略地講是，使用乙腈HPLC級最好，在選擇性，峰形差時試用甲醇HPLC，但根據各種不用性質設計分析條件也是必要。