色譜分離技術

色譜有多種，按固定相類型和分離原理可分為吸附色譜、分配色譜、離子交換色譜、親和色譜、大孔吸附樹脂、凝膠色譜、聚焦色譜等。最常用的是吸附色譜分離技術。

吸附色譜法是指混合物隨流動相通過吸附劑（固定相）時，由於吸附劑對不同物質具有不同的吸附力而使混合物中各組分分離的方法。此法特別適用於脂溶性成分的分離。被分離的物質與吸附劑、洗脫劑共同構成吸附層析的三要素，彼此緊密相連。

常用的極性吸附劑有：硅膠、氧化鋁。硅膠顯弱酸性，適於分離酸性和中性化合物，分離生物鹼時需在流動相中加入適量的有機鹼；氧化鋁呈鹼性，適於分離生物鹼等鹼性成分，不宜用於分離有機酸等酸性成分。極性吸附劑的吸附作用有以下特點。

1．被分離物質極性越強，吸附力越強。強極性溶質將優先被吸附。

2．溶劑極性越弱，則吸附劑對溶質的吸附能力越強。隨溶劑極性的增強，則吸附劑對溶質的吸附力將減弱。

3．當加入極性較強的溶劑后，先前被硅膠或氧化鋁所吸附的溶質可被置換而洗脫出來。

活性炭是常用的非極性吸附劑。活性炭對非極性物質具有較強的親和力，在水中對溶質表現出強的吸附能力。從活性炭上洗脫被吸附的物質時，溶劑的極性越小，洗脫能力越強。一般化合物的極性按下列官能團的順序增強：—CH2—CH2—，—CH==CH—，—OCH3，—COOR，>C==O，—CHO，—NH2，—OH，—COOH。

在生物大分子純化分析特別是蛋白質純化分析中，色譜是非常重要而且常用的一種技術。

一、凝膠過濾

凝膠過濾又叫分子篩色譜，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾色譜柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。

二、離子交換色譜

離子交換色譜是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。

三、吸附色譜

1、吸附柱色譜

吸附柱色譜是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩衝液為流動相構成柱的一種色譜方法。

2、薄層色譜

薄層色譜是以塗佈於薄板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種色譜方法。這種色譜方法是把吸附劑等物質塗佈於載體上形成薄層，然後按紙色譜操作進行展層。

3、聚醯胺薄膜色譜

聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。色譜時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。

四、親和色譜

親和色譜是根據生物大分子和配體之間的特異性親和力，將某種配體連接在載體上作為固定相，而對能與配體特異性結合的生物大分子進行分離的一種色譜技術。親和色譜是分離生物大分子最為有效的色譜技術，解析度很高。

親和色譜的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物（S''）才能和一定的酶（E）結合，產生複合物（E－S''）一樣。在親和色譜中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，併產生複合物。而親和色譜與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體（類似底物）是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和色譜是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑製劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M（如活化瓊脂糖等）上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化后的配體仍保持束縛特異物質的能力。

因此，當把圍相載體裝人小色譜柱（幾毫升到幾十毫升床體積）后，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩衝液洗滌出來，並形成了第一個色譜峰。然後，恰當地改變起始緩衝液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個色譜峰（見圖6－2）。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，採用選擇性緩衝液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理后，可以重複使用。

上面介紹的親和色譜法也是特異性配體親和色譜法。另外還有通用性配體親和色譜法。這兩種親和色譜法相比，前者的配體一般為複雜的生命大分子物質（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高色譜的解析度。

五、聚焦色譜

聚焦色譜也是一種柱色譜。因此，它和另外的色譜一樣，照例具有流動相，其流動相為　多緩衝劑，固定相為多緩衝交換劑。

聚焦色譜原理可以嘗試從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。

1、PH梯度溶液的形成

在離子交換色譜中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子劑進行色譜時，製備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室（這色譜柱者）中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開色譜柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦色譜中，當洗脫液流進多緩衝交換劑時，由於交換劑帶具有緩衝能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。

2．蛋白質的行為

蛋白質所帶電荷取決於它的等電點（PI）和色譜柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反覆進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。

不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。