出凝血時間

出血時間測定有三種方法：即，Duke法、Ivy法、出血時間測定器法。

Duke法：操作雖簡單，但穿刺深度，寬度難以標準化，且受穿刺部位毛細血管分佈及血管收縮程度的影響，致使實驗的敏感性很差。文獻記載，血小板低於3×109/L的患者陽性率僅為42%，遺傳性假血友病(VWD)患者陽性率為32%，而測定器法分別為92%和67%。

Ivy法：雖較Duke法敏感，操作繁瑣，又是損傷性的，切口難以標準化，也不易住推廣。

出血時間沉定器法：由於刀片埋裝在儀器內部，由彈簧快速彈出，使切口深度，寬度易於控制，可標準化且靈敏度高。因此，文件中規定出血時間測定實驗應使用出血時間測定器法，而廢除Duke法。

臨床意義

1.當血小板數目減少或功能缺陷時，不能形成血栓，出血時間即延長。常見於血小板減少性紫癜、急性白血病、再生障礙性貧血等。嚴重的凝血酶原減少亦可引起出血時間延長。

2.出現時間除了與血小板的數量與機能有關外，還與毛細血管的收縮和粘合能力以及血清素等物質的釋放有關。如毛細血管病變，收縮功能障礙出血時間也延長。

3.由於毛細血管原因所引起的出血時間延長，如血管性假血友病，常常是在身體某一部位出血時間延長，而其他部位正常，因此，必須同時做兩側耳垂或手指的出血時間測定，以資鑒定。

凝血時間試驗是指血液自血管抽出放入試管中，從液態的溶膠狀態轉為半固體凝膠狀態所需要的時間。出血后，血液(或血漿)中的Ⅻ因子被激活后，處於酶原狀態的凝血因子Ⅻ,Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ,Ⅹ,Ⅴ依次被激活，連續"放大"，最終使纖維蛋白原生成纖維蛋白。後者呈網狀結構，網羅血小板栓子和紅細胞后，收縮形成牢固的血塊。這一過程需要Ⅻ、Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ、Ⅹ、Ⅴ、Ca2+、凝血酶原及纖維蛋白原等凝血因子的參與，其中任一因子缺乏均可引起上述"連續放大"過程障礙，造成凝血不良。因此凝血時間延長，可反映上述因子缺乏。此試驗反映記錄的是整個凝血過程，對Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子較為敏感，只有凝血酶原,凝血因子X,纖維蛋白原明顯減低時才顯示實驗結果延長。

凝血時間實驗大致有6種測定方法。王鴻利等用6種凝血時間測定對12例重型血友病（Ⅷ因子活性<1%），4例中型血友病（Ⅷ因子活性1%~5%）進行測定，結果（檢出率/病例數）為：毛細血管法，重型1/12，中型0/4；玻片法，重型2/12，中型0/4；普通試管法，重型12/12，中型2/4；APTT，重型12/12，中型4/4；硅化管，重型12/12，中型4/4；ACT法，重型12/12，中型4/4。從中可以看出，毛細血管法和玻片法很不敏感，不能再用於Ⅺ、Ⅸ、Ⅷ因子的篩選實驗。普通試管法簡單且較敏感，標本用量較少，可用於常規檢查，但由於手工操作，需注意實驗器材的標準化。APTT簡便快速，市面上有各型凝血儀，可用於不同規模實驗室，且有配套的試劑、質控物、校準物，易於質量控制，是較理想的常規實驗方法。APTT也可手工完成，但影響因素較多，在標本量較多時，不適用。

臨床意義

1.凝血時間延長，主要見於血液中凝血因子缺乏或抗凝物質增加時，如血友病、肝脾病、急性傳染病等。血友病患者的凝血時間可長達1~2小時以上。血液中抗凝物質增多常見於應用肝素治療時，如斷肢再植術后。此外，血小板嚴重減少時亦可引起凝血時間延長。

2.凝血時間縮短主要見於各種原因如休克，急性腎功能衰竭、敗血症等引起的彌散性血管內凝血（簡稱DIC)。反覆測定凝血時間，如每次都短於3分鐘，說明血液有凝固的趨勢，即應當想到有血管內凝血(DIC)D的可能。

為了避免術中出血，手術前進行出血傾向的檢查非常必要，由於影響止血的因素很多，但又不可能做許多實驗，因此，以往常規中用出血時間和凝血時間作為診斷指標，結果異常時再進一步做較複雜的試驗尋找病因。前已述及,Duke法雖簡單適於常規應用，但敏感性很差，不能達到診斷要求，而出血時間測定器方法，操作複雜，費時，不適合常規使用。雖是反映血管，血小板數量和質量方面的病理變化，但臨床最常見的是血小板減少引起變化。而血管性疾病和血小板質量異常引起的疾病多是遺傳性疾病,發病率很低，且基本上能在臨床表現，體征和病史中反映出來，可提示做一些確診試驗。從這個意義上講，手術前只要做一項血小板計數而不做出血時間，也基本上能保證手術前篩查的要求。

APTT法僅對凝血階段Ⅺ,Ⅸ,Ⅷ因子敏感。為此，在進行APTT檢測同時還應再檢查PT,以保證能檢出由於凝血酶原,Ⅴ因子,Ⅵ因子缺乏而引起的出血傾向。

1.PT,APTT凝血實驗檢查均使用靜脈血。采血人員應技術熟練，以防止組織損傷，外源性凝血因子進入針管.

2.凝血實驗標本最好不與其他實驗一起採集，否則由於標本的分配，分裝等使用血液停留在針管的時間延長。一般血液採集，進入容器至進行實驗所用的時間越短，所分析的凝血因子被保護得越好。從輸液三通管取出血的做法不可取.

3.取血時病人應鬆弛，環境溫暖，防止靜脈攣縮,止血帶的壓力要儘可能小，壓力大及束縛時間長可影響局部血液的濃縮和內皮細胞釋放組織纖溶酶原活物(t-PA),後者將引起纖溶性增強，血小板短和內徑應標準化，國際上推薦用21G1.5或20G1.5針頭。取血時，拉針栓的速度要慢而均勻，使血液平穩地進入注射器，防止氣泡的產生.

4.一旦取樣完畢，立即與抗凝劑充分混合，一般提倡使用真空采血管。此管有充分的透明度，根據取血量設計，有2.0,5.0,10ml各種血液收集管，真空負壓並有定量的抗凝劑，能保證抗凝劑與取血量的比例，且能有充分的空間便於血液和抗凝劑混合.

5.用硅化玻璃或塑料注射器采血。考慮結果的精確性，應將試管刻度的可能誤差控制在既定體積的10%以內.

6.采血后標本在低溫保存且在一定時間範圍內。筆者曾對不同條件保存的血漿因子變化進行了探討，結果顯示在32℃保存血漿6,12,24hⅧ因子活性可分別消失50%,60%95%,即使保存在4℃也分別消失5%,55%,70%.V因子活性在32℃分別消失25,40,80%,而在4℃則僅損失0%,5%,10%.因此測定APTT的血漿在-80℃至少可保存1個月,4℃為6h,20℃為6h,而32℃僅為血漿，在4℃為24h,20℃為6h,32℃為2h.

7.國際血液學標準化委員會(ICSH),國際血栓與止血委員會(ICTH)推薦使用3.2g/dl(含2H2O)或0.109mol/L的枸櫞鈉作為凝血因子檢查的抗凝劑。另外，近年來，許多試驗室採用緩衝抗凝劑，這種試劑對標本經冷凍保存后再行分析更為適宜。因為無緩衝劑，血漿pH值隨時間而增加，凝固時間可延長，特別是Ⅷ因子即使是在-20℃保存，其凝血活性也可減少50%.緩衝劑的作用是維持血漿恆定pH,防止易變因子失活。抗凝劑在血標本的絕對含量可改變血漿中鈣離子濃度，進而影響試驗結果，一定要注意采血時血液與抗凝劑的比例。應指出，所謂血液與抗凝劑按9:1比例混合，實際上是指抗凝劑與正常壓積血液之間的比例而言。因此應根據患者紅細胞比例(Hct)狀況隨時調整抗凝劑用量.

1.凝血活酶應注意的問題:

(1)組織凝血活酶標準化應用的國際參考品(internationalreferencepreparation,IRP),有下列幾種：單一組織凝血活酶國際參考品：是一種組織提取物的生理鹽水懸液製劑.WHO在英國使用的統一標準的"英國比較凝血活酶",編號67/40.同時又以BCT67/40為基礎標準化了次級參考品。如牛腦組織凝血活酶，編號68/434;兔腦為70/178等.複合組織凝血活酶國際參考品：它是組織提取物的生理鹽水懸液中加入適量纖維蛋白原,因子V和氯化鈣組成的製劑，如牛組織凝血活酶OBT/79等.

(2)組織凝血活酶工作製劑的國際敏感指數(ISI),由於不同組織凝血活酶對凝血因子的敏感性不同。為了使不同敏感性的組織凝血活酶在檢測PT中能得到同樣的結果，必須要制定一個共同的敏感性指標。自製的試劑要與國際參考品(IRP)進行比較，然後得出一個校正值(即ISI).ISI值越接近於1.0,表明組織凝血活酶試劑越敏感，因此,生產和出售得產品必須標有ISI.

(3)儀器特有的ISI:上述PT根據報告方式適用於手工法(試管傾斜法)測定PT.但是手工法與儀器法以及儀器法與儀器法測定PT的國際標準化比值(INR)之間，仍有差異。為此，專家們提出建議：同一組織凝血活酶試劑用於不同儀器時，可用所謂的"儀器特有的ISI"或稱區域性ISI來計算INR.每台儀器所用的凝血活酶試劑都應該有特定的ISI值，重新標定ISI值的做法是購買標有INR的凍乾血漿，然後在自己的儀器上再標定所使用凝血活酶試劑的ISI值，這樣才可使病人的INR具有可比性.

(4)某些凝血活酶和部分活化凝血活酶並不一定與某此儀器相匹配。渾濁的或含微粒的凝血活酶和部分活化凝血活酶不能運用通過光學系統測定終點的儀器進行檢測.

(5)凝血活酶和部分活化凝血活酶的使用步驟必須嚴格按照說明書進行。通常在使用前必須充分混勻試劑，以使微粒重新均勻懸浮於液體中。按說明書要求的溫度存放試劑，並且試驗過程中，將試劑置於37℃下的時間不能長於說明書中規定的溫度.

(6)做APTT實驗時所用的活化劑不同，對血內肝素,狼瘡抗凝物質及因子Ⅷ,Ⅸ缺乏症的敏感性也不同，要根據檢測項目來選擇不同活化劑的APTT試劑。同樣PT延長時反遇有關凝血因子中單一因子或幾個因子缺陷引起的病理現象，由於不同疾病可能僅反映某一因子的變化，因此一種特定試劑不可能對這些疾病的變化的敏感性一致。由於不同廠家生產的PT試劑質量不同，因此，同一份標本用不同PT試劑其結果可有明顯的差異。因此PT實驗最好採用INR的報告方式.

2.試劑準備過程中應該使用去離子水。如果pH值增高的水沒有得到適當的緩衝，將會延長測定結果。如果用含氨的水配製抗凝劑，會導致V因子活性快速降低，從而延長凝血酶原時間。凝血活酶，部分活化凝血活酶，緩衝液和抗凝劑須在4-10℃條件下貯存，但在室溫下保存氯化鈣和水.

3.正常對照血漿通常將多份健康人血標本混在一起，以彌補個體誤差。正常對照血漿要求20份以上健康，年齡在18-55歲間的男女個體，且刪除服藥者，須在平靜，休息狀態抽血。樣本離心取出血漿后混勻，分裝小瓶，凍存於-80℃備用，或冷凍乾燥.

4.參比血漿：標準化是質控的重要組成部分，方法標準化對有的實驗室來說是困難的，因有設備條件方面的限制。為了使結果大同一實驗室的不同時期具有可比性，必須使用標準品或參比血漿.WHO已建立了10多種國際標準品.

1.玻璃器皿的要求：貯存和測試時應選用乾淨，沒有划痕的試管。酸清洗法(鹽酸3mol/L)被公認為適用於凝血研究清洗玻璃製品的最佳方法。玻璃製品必須通過徹底沖洗，以去除殘留的酸，避免改變容器表面的pH值。一次性玻璃和塑料製品分開保存。手工法PT或試管法全血凝固時間測定時，試管口徑為8mm,直徑越大,CT越長.

2.溫度的要求：人工測定終點法要求水浴箱的溫度必須保持在(37±1)℃,並且周圍照明設備要好，便於讀取終點。如果為了讀數而將試管從水浴箱中拿出，傾斜觀察，此時動作應迅速，否則試管中的血漿溫度將很快下降.

3.儀器的選擇：自動終點測定法有半自動和全自動兩種類型，區別在於前者在試劑和血漿移液步驟上仍是手工的；而後者完全由儀器自動操作。自動終點法測定所得結果重複性好，大大提高了不同試驗室結果間的可比性.

應該根據儀器的精密度，可靠性，使用和維修的簡易程度來選擇所購買儀器。現在已有不少用合成底物法代替以凝固為終點的生物學測定法的報道。但是，這兩種測定方法的臨床意義不盡相同.

1.許多試驗誤差都來源於技術的錯誤。在實驗技術，試劑，溫度及pH值上很微小的變化都會導致試驗結果明顯的變化。孵育時間與溫度是在一期法凝血酶原時間測定時應嚴格控制的參數。血漿不能在37℃下放置超過10min,凝血活酶放置時間也不能超過說明規定的時限.

2.手工法PT或試管法CT檢查時，傾斜試管動作一定要輕，角度要小，以減少血液與管壁的接觸面積。同一標本要做二管(有文獻報告試管法CT檢查要3管)並取均值報告。每批實驗必須有正常對照.

3.血液凝固主要是酶催化的反應，所以實驗過程中要嚴格控制理想的pH環境和溶液的離子強度.多數常規試驗都在處於血液生理pH值緩衝範圍的緩衝系統中進行。反應混合物的pH值必須處於7.2-7.4之間.

4.試驗結果準確還取決於所用的反應物的量，加入順序和不同反應物的孵育時間。如每次APTT試驗時，活化部分凝血活酶試劑和血漿混合物的孵育時間必須一致.混勻過程決定了APTT試驗中接觸活化的量，在孵育時如果在活化部分凝血活酶與血漿混合的技術不佳，將會改變測定結果。

5.APTT,PT需乏血小板血漿。一般3000r/min離心10min後分離血漿。離心前注意標本量，離心后注意血漿的量(Hct)以保證抗凝劑與標本量最適比例.

6.試驗前檢查血漿是否有溶血,黃疸,脂血和出現凝塊.紅細胞膜含有磷脂，溶血標本具有與血小板第Ⅲ因子(磷脂)相似的凝血活性，這種磷脂能縮短溶血血漿的APTT值。標本中如果出現凝塊，無論凝塊多麼小，均會影響試驗結果.

7.報告方式:(1)以PT的秒(s)數報告.(2)以患者PT(s)/正常對照(s)的比(PTR)報告.(3)在口服藥物治療監控時以INR報告.(4)ICSH規定，不再用百分比(活動度)報告.(5)APTT以秒報告。

繪製質控圖並隨時分析其變化趨勢是質量控制的重要手段。在每天工作中，同時測正常和氨基常對照血漿(商品或自製),並用Levey-Jeuny質控圖檢查有無失控。其步驟為，首先在常規的實驗條件下(包括高素質的實驗人員，規範的操作，穩定的儀器),對質控品至少進行10次測量，計算出X及標準差，然後繪出質控圖，質控物的X值為基線，縱軸有X±2s.每次試驗時質控物與標本一起檢測，並把當日的結果點在圖表上。下列的質量變化圖形有利於操作人員判斷結果是否有所失控。當失控時，按下述步驟(圖1)檢查原因.

室間質評：各實驗室必須積極參加由檢驗中心組織的室間質評活動，以便了解本單位的結果準確性,因儀器和試劑不同，同一份質控血漿可行到不同結果，應將回報結果根據儀器試劑分組比較.

文獻報道，手工法APTT的參考值為31.5-43.5s，女性為32-43s.兩者無顯著差異。

受檢查的測定值較正常對照延長超過10s以上才有病理意義。手工法PT參考值為11-14s，超過正常對照3s為異常，PTR參考值為1±0.15.

因儀器、試劑的不同，會得到不同的結果，因此儀器法很難規定統一的參考值，各實驗室應根據自己的儀器、試劑等條件，自行測定一批健康人，建立參考值。此後至少每年或條件有變化時，根據新的條件，重新建立參考值。至少選擇40名18-55歲之間男性及非妊娠，月經期女性(男女各半)、身體健康，半月內無服藥史，在平靜休息的狀態采血且分開幾天采血和測定(以減少批間差異).在常規檢測示本的條件下進行試驗。測定結果經統計學處理，計算標準差，取95%可信限為參考值範圍。