遺傳毒性試驗

遺傳毒性試驗能檢出DNA損傷及其損傷的固定。以基因突變、較大範圍染色體損傷、重組和染色體數目改變形式出現的DNA損傷的固定，一般被認為是可遺傳效應的基礎，並且是惡性腫瘤發展過程的環節之一（這種遺傳學改變僅在複雜的惡性腫瘤發展變化過程中起了部分作用）。染色體數目的改變還與腫瘤發生有關和可提示生殖細胞發生非整倍體的潛在性。在檢測這些類別損傷的試驗中呈陽性的化合物為潛在人類致癌劑和/或致突變劑。由於在人體中已建立了某些化合物的暴露和致癌性之間的關係，而對於遺傳性疾病尚難以證明有類似的關係，故遺傳毒性試驗主要用於致癌性預測。但是，因為已經確定生殖細胞突變與人類疾病有關，所以對可能引起可遺傳效應的化合物與可能引起癌症的化合物應引起同樣的關注；此外，這些試驗的結果可能還有助於致癌性試驗分析。

遺傳毒性研究在藥物研發中處於比較的重要位置，尤其是在藥物篩選階段，在很大程度上遺傳毒性試驗結果將影響到藥物開發的進程。但是遺傳毒性的假陽性和假陰性結果難以避免，尤其是近年來體外哺乳動物細胞試驗系統陽性結果（該結果與人用危險不相關）過高的問題已引起的廣泛關注。因此對結果進行綜合分析尤為重要。FDA於2006年出台了推薦的遺傳毒性試驗結果綜合分析法指導原則（Guidanceforindustyandreviewstaff:Recommendedapproachestointegrationofgenetictoxicologystudyresults），對遺傳毒性試驗出現陽性結果如何評價和處理進行了討論。現介紹ICHS2（R1）中的遺傳毒性結果評價和追加試驗策略。

對比試驗已明確顯示，在預測藥物對嚙齒類動物致癌性時每種體外檢測系統均可產生假陰性和假陽性結果。遺傳毒性試驗組合（包括體內和體外試驗）檢測的是被認為主要通過直接的遺傳損傷機制的致癌劑，如絕大多數已知的人類致癌劑。因此，這些組合無法檢測出非遺傳毒性致癌劑。體外試驗的一些實驗條件，如體外代謝活化系統有限的能力，可能導致假陰性結果。試驗組合方法的設計是為了減少有潛在遺傳毒性化合物的假陰性結果的風險，但是，任何一種遺傳毒性試驗中的陽性結果並不一定能說明受試物對人體真正具有遺傳毒性或致癌性的危險。

近十幾年，隨著遺傳毒理學相關領域特別是分子生物學的研究進展，遺傳毒性測試評價方法也在不斷改進。據報道，目前已建立的遺傳毒性短期檢測法已超過200種。根據其檢測的遺傳學終點可分為4種類型:1檢測基因突變;2檢測染色體畸變;3檢測染色體組畸變;4檢測DNA原始損傷。

1　現行組合試驗方案由於一種遺傳毒性檢測方法通常只能反映一個或兩個遺傳學終點。沒有一種檢測方法能涵蓋所有的遺傳學終點，故需用一組試驗配套進行試驗。200多種檢測方法中，真正經過驗證有合適靈敏度和特異度的大概不到10種。目前多數國家規定，如體內誘變試驗顯示1個或以上試驗呈陽性結果，則需要進行生殖細胞遺傳毒性測試。

2　各類遺傳毒性試驗方法的研究進展

2.1　檢測基因突變

2.1.1　Ames試驗　Ames試驗是檢測化學物質基因突變的常用方法。常規的Ames試驗選用四個測試菌株(TA97、TA98、TA100、TA102),最近有人提出增加TA1535測試菌株，該菌株特別適用於檢測混合物的致突變性。目前出現的新生菌株具有更高的敏感性和特異性，如YG7014、TG7108,缺乏編碼O6-甲基鳥嘌呤DNA甲基化轉移酶的ogtST基因，專用於對烷化劑引起的DNA損傷檢測；引入乙醯轉移酶基因的YG1024、YG1029菌株，對硝基芳烴和芳香胺的敏感性比原菌株高100倍以上。測試代謝活化系統一般採用由Aro-clor1254(PCBs)誘導大鼠肝微粒體酶的S9;國外也有用人肝S9的報道，試驗證明其代謝活性明顯高於鼠S9[5,6]。為了克服S9製備上的困難和不穩定性,Josephy等將沙門氏菌的芳香胺N-乙醯轉移酶基因和人類細胞色素P-450基因Cyp1A2引入細胞，構建了在無外源S9時也可檢出芳香胺誘變性的Ames測試菌株如DJ4501A2。

2.1.2　TK基因突變試驗　TK基因突變試驗是一種哺乳動物體細胞基因正向突變試驗，近年來其應用價值有明顯的提高。TK基因編碼胸苷激酶，該酶催化胸苷的磷酸化反應，生成胸苷單磷酸(TMP)。如果存在三氟苷(TFT)等嘧啶類似物，則產生異常的TMP,摻入DNA中導致細胞死亡。如受檢物能引起TK基因突變，胸苷激酶則不能合成，而在核苷類似物的存在下能夠存活。TK基因突變試驗可檢出包括點突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大範圍基因組改變在內的多種遺傳改變。試驗採用的靶細胞系主要有小鼠淋巴瘤細胞L5178Y以及人類淋巴母細胞TK6和WTK1等。其基因型均為tk+/-。Honma(本間正充)和張立實(1999)指出原用染毒時間3～6h對於充分檢出斷裂劑和錘體來說這個時間太短，獲陰性結果時應延長至24h。據資料顯示對於同一陽性受檢物,WTK1細胞的突變頻率遠高於TK6細胞，認為與WTK1存在p53基因突變有關。Do-brovolsky(1999)建立了tk+/-轉基因小鼠，可用於體內試驗。

2.1.3　轉基因小鼠基因突變試驗　轉基因小鼠基因突變試驗可在整體狀態下檢測基因突變，比較不同組織(包括生殖腺)的突變率，確定靶器官，對誘發的遺傳改變作精確分析等。1989年Gossen等報道了LacZ轉基因小鼠突變測試系統。近年來，國外已陸續發展了多種用於突變檢測的轉基因動物，其中3種已投入商品化生產,MutaTM小鼠、Big-BlueTM小鼠和Xenomouse小鼠，它們分別採用大腸桿菌乳糖操縱子的LacZ和/或Lacl作為誘變的靶基因。陳建泉等人(1997)已經以穿梭質粒pESnx載體，以xy1E基因因為誘變靶基因建立了攜帶xy1E的轉基因小鼠，並對轉基因小鼠進行了繁殖建系。並已實驗證明xy1E轉基因小鼠是一個研究體內基因突變的有效模型，它可望成為一種新的轉基因小鼠突變檢測系統。Heddle等(2000)建立了1個種gptdelta轉基因小鼠。HiroyukiHayashi等(2003)將載有E.coligpt基因和λ噬菌體的red/gam基因λEG10DNA整合到SD大鼠每個單倍體基因組q24～q31位點。這種轉基因大鼠對乙基亞硝基脲(ENU)和苯並芘(B[a]P)的肝臟毒性顯示了很好的敏感性，它也有助於研究遺傳毒性物質對小鼠和大鼠的種間差異。

2.1.4　反向限制性酶切位點突變分析法(inverserestrictionsitemutation,iRSM)由英國威爾士大學分子遺傳和毒理中心建立並完善的。iRSM適用於快速檢測誘變劑所致體內外DNA的突變，但這些突變的特點是使某一酶切位點變為另一酶切位點。該方法建立者Jenkins等首先將iRSM應用於化學誘變劑所致動物體內p53基因的突變檢測，取得了良好的結果：小鼠分別口服N-乙基N-亞硝基脲(ENU)、2-乙醯氨基芴(2-AAF)和二甲基醯肼(DMH)3天後，以iRSM方法相應地檢測小鼠脾、骨髓和肝組織p53基因第6內含子區域的Apa→Ava位點反向突變。結果表明ENU誘發肝組織p53基因突變的發生率為33%,2-AAF使肝組織突變的發生率為25%,這一陽性突變率反映出了不同誘變劑對相應組織的致突變強度，進一步驗證了該方法的高靈敏度和準確性。它具有靈敏度高、快速、操作簡便、以及突變檢測部位明確等優點，應當說是一種較具實用價值和生命力的突變檢測手段。但是,iRSM的不足之處是僅能檢測誘發限制性酶切位點反向的DNA突變。根據文獻資料分析，化合物致突的發生具有一定的規律性，即結構類似的一組化合物常常引起一些特定序列較固定的鹼基改變。例如，烷化劑和芳香胺類雖易使一連串鳥嘌呤(G)3′端G發生突變[12,13],這可能與該部位電荷密集有關，多數活性氧生成物質的DNA致突作用也具有類似規律;CpG二核苷常常是DNA加成物致突變作用部位，所以CpG突變的檢測在化合物致突檢測中具有重要意義，而CpG突變常引發某些固定酶切位點的變化。很顯然,iRSM可較廣泛地應用於遺傳毒性化合物致突作用的檢測。2.2　檢測染色體和染色體組畸變

2.2.1　微核試驗　傳統的體內微核試驗仍然是檢測化學物質染色體損傷的基本方法。目前微核試驗方法主要有以下改進:1體外微核試驗　常用細胞有中國倉鼠肺細胞(CHL)、中國倉鼠卵巢細胞(CHO)及中國倉鼠成纖維細胞(V79)等，近年開始有用L5178Y小鼠淋巴瘤細胞和人的類成淋巴細胞TK6。也有用敘利亞倉鼠胚胎(SHE)細胞和BALB/c3T3細胞。體外試驗比體內試驗易於操作和控制。缺點是對直接作用的化合物有可能出現假陽性。2周圍血微核試驗　優點是可重複採樣，自身對照，減少實驗動物數。李尊愛(1999)報道剛斷乳不久的小鼠(4～6周齡)用於外周血網織紅細胞微核試驗比年齡更大的敏感些。3胞質分裂阻滯法微核試驗(CB-MNT)　很好地排除了細胞分裂的影響。該法中，雙核細胞是只分裂了一次的細胞，其結果更加穩定敏感。CB-MNT可觀察到多種遺傳學終點。觀察不同分裂期的細胞比例，計算核分裂指數能檢測誘變物對細胞周期的影響。還可檢測切除修復，次黃嘌呤磷酸核糖轉移酶(HPRT)位點變異，凋亡。認為該試驗可使計數值提高，達到傳統方法的兩倍或以上。但也偶小於兩倍的結果(李來玉,1996)。最近Garriott和Phelps等推薦了關於體外雙核細胞微核試驗的幾個參數條件:細胞鬆弛素B不影響試驗結果；計數2000個雙核細胞；長時間暴露沒有必要；結果用趨勢檢驗分析；根據相應的細胞毒性選擇適當的濃度。

2.2.2　染色體畸變試驗　染色體畸變試驗是檢測化學物質影響染色體數量和結構的基本方法。在化學物質安全性評價中常選體外CHL細胞染色體畸變、精原細胞染色體畸變試驗等檢測化學物質對染色體的影響。為了準確觀察誘發的畸變頻數，本試驗收穫細胞的時間應盡量提前至大多數細胞處於染毒后第1次有絲分裂時(Tucker,1996)。對於染色估數目改變，原則上只適合超倍體的觀察。因為塗片時可能人為地把染色體推出細胞外(Tucker,1997),Danford曾建議在製備標本時減弱低滲處理能力，以免漲破細胞膜，從而能準確觀察亞二倍體。經研究，認為以0.094mo1/LKC1弱低滲液處理2min～3min是達此目的的最佳條件(樓鐵柱,1997)。

2.2.3　熒光原位雜交(FISH)技術　熒光原位雜交最早由Bauman(1980)建立，後由Lucas(1989)首先應用於染色體畸變分析。其原理是按檢測目標準備恰當的DNA序列作為探針，並用生物素標記，對載玻片上待測標本中的DNA雜交，最後通過雜交位點的熒光觀察染色體結構或數目的改變。應用特殊染色體和染色體某區域的熒光探針可在體內檢測4種類型的細胞遺傳學終點。1檢測中期細胞染色體畸變。2應用亞染色體區域的探針檢測間期染色體斷裂和非整倍體。3應用中心粒探針和/或抗著絲點抗體檢測微核的形成。Schriever-Schwemmet等利用CREST間接免疫熒光法，以及小鼠次要和主要衛星DNA探針，在小鼠骨髓細胞證明了受試物引起微核的來源。4哺乳動物精子非整倍體檢測。徐德祥(1999)用雙色FISH方法對丙烯腈接觸男工精子性染色體數目畸變進行了檢測，證明FISH技術用於檢測精子染色體數目畸變實驗結果穩定可靠。

2.3　檢測DNA原始損傷2.3.1　單細胞凝膠電泳技術　單細胞凝膠電泳分析(singlecellgeleletrophoresis,SCGE)是Ostling等(1984)首創的，以後經Singh等(1988)進一步完善而逐漸發展起來的一種快速檢測單細胞DNA損傷的實驗方法，因其細胞電泳形狀頗似慧星，又稱慧星試驗(cometassay)。Kizilian(1999)改進了一些試驗條件，能明顯將細胞調亡和細胞壞死的形象與“彗星”區分。MarkS.Rundell等(2003)報道彗星試驗測行的損傷主要是由致突變劑引起的。RichardD.Bowden等(2003)研究出了一種新的分析試驗結果的彗星尾圖譜，可以更加準確的分析彗星的長度及密度。SCGE是評價遺傳毒性損害非常敏感的實驗，可以檢測到每1.657×10-37kg中0.1個DNA的斷裂。與經典的染色體畸變、微核、SCE相比,SCGE可以用於活細胞DNA的檢測，也能用於死亡細胞DNA的分析，使SCGE不僅可以研究低劑量下的生物效應，也可用於研究高劑量下的生物效應；同時SCGE又可提供DNA修復能力的信息，這使得SCGE非常適用於評價受試物的遺傳毒性。