紫外－可見分光光度法

光譜法（spectrometry）是基於物質與電磁輻射作用時，測量由物質內部發生量子化的能級之間的躍遷而產生的發射、吸收或散射輻射的波長和強度進行分析的方法。光譜法可分為發射光譜法、吸收光譜法、散射光譜法；或分為原子光譜法和分子光譜法；或分為能級譜，電子、振動、轉動光譜，電子自旋及核自旋譜等。

分光光度法是光譜法的重要組成部分，是通過測定被測物質在特定波長處或一定波長範圍內的吸光度或發光強度，對該物質進行定性和定量分析的方法。常用的技術包括紫外-可見分光光度法、紅外分光光度法、熒光分光光度法和原子吸收分光光度法等。

常用檢測儀器：紫外-可見分光光度計。

原理如下：

單色光輻射穿過被測物質溶液時，在一定的濃度範圍內被該物質吸收的量與該物質的濃度和液層的厚度（光路長度）成正比，其關係可以用朗伯-比爾定律表述如下：

式中

A為吸光度；

T為透光率；

E為吸收係數，常用的表示方法，其物理意義為當溶液濃度為1%（g/ml）,液層厚度為1cm時的吸光度數值；

c為100ml溶液中所含物質的重量（按乾燥品或無水物計算），g；

l（L）為液層厚度，cm。

上述公式中吸收係數也可以摩爾吸收係數ε來表示，其物理意義為溶液濃度c為1mol/L和液層厚度為1cm時的吸光度數值。在最大吸收波長處摩爾吸收係數表示為εmax。

物質對光的選擇性吸收波長，以及相應的吸收係數是該物質的物理常數。在一定條件下，物質的吸收係數是恆定的，且與入射光的強度、吸收池厚度及樣品濃度無關。當已知某純物質在一定條件下的吸收係數后，可用同樣條件將該供試品配成溶液，測定其吸光度，即可由上式計算出供試品中該物質的含量。在可見光區，除某些物質對光有吸收外，很多物質本身並沒有吸收，但可在一定條件下加入顯色試劑或經過處理使其顯色后再測定，故又稱之為比色分析。

紫外-可見分光光度計由5個部件組成：①輻射源。必須具有穩定的、有足夠輸出功率的、能提供儀器使用波段的連續光譜，如鎢燈、鹵鎢燈（波長範圍350～2500納米），氘燈或氫燈（180～460納米），或可調諧染料激光光源等。②單色器。它由入射、出射狹縫、透鏡系統和色散元件（稜鏡或光柵）組成，是用以產生高純度單色光束的裝置，其功能包括將光源產生的複合光分解為單色光和分出所需的單色光束。③試樣容器，又稱吸收池。供盛放試液進行吸光度測量之用，分為石英池和玻璃池兩種，前者適用於紫外到可見區，後者只適用於可見區。容器的光程一般為0.5～10厘米。④檢測器，又稱光電轉換器。常用的有光電管或光電倍增管，後者較前者更靈敏，特別適用於檢測較弱的輻射。近年來還使用光導攝像管或光電二極體矩陣作檢測器，具有快速掃描的特點。⑤顯示裝置。這部分裝置發展較快。較高級的光度計，常備有微處理機、熒光屏顯示和記錄儀等，可將圖譜、數據和操作條件都顯示出來。

儀器類型則有：單波長單光束直讀式分光光度計，單波長雙光束自動記錄式分光光度計和雙波長雙光束分光光度計。

應用範圍包括：①定量分析，廣泛用於各種物料中微量、超微量和常量的無機和有機物質的測定。②定性和結構分析，紫外吸收光譜還可用於推斷空間阻礙效應、氫鍵的強度、互變異構、幾何異構現象等。③反應動力學研究，即研究反應物濃度隨時間而變化的函數關係，測定反應速度和反應級數，探討反應機理。④研究溶液平衡，如測定絡合物的組成，穩定常數、酸鹼離解常數等。

1.波長

由於環境因素對機械部分的影響，儀器的波長經常會略有變動，因此除應定期對所用的儀器進行全面校正檢定外，還應於測定前校正測定波長。常用汞燈中的較強譜線237.83nm，253.65nm，275.28nm，296.73nm，313.16nm，334.15nm，365.02nm，404.66nm，435.83nm，546.07nm與576.96nm；或用儀器中氘燈的486.02nm與656.10nm譜線進行校正；鈥玻璃在波長279.4nm，287.5nm，333.7nm，360.9nm，418.5nm，460.0nm，484.5nm，536.2nm與637.5nm處有尖銳吸收峰，也可作波長校正用，但因來源不同或隨著時間的推移會有微小的變化，使用時應注意；近年來，常使用高氯酸鈥溶液校正雙光束儀器，以10%高氯酸溶液為溶劑，配製含氧化鈥（Ho0）4%的溶液，該溶液的吸收峰波長為241.13nm，278.10nm，287.18nm，333.44nm，345.47nm，361.31nm，416.28nm，451.30nm，485.29nm，536.64nm和640.52nm。

儀器波長的允許誤差為：紫外光區±1nm，500nm附近±2nm。

2.吸光度的準確度

可用重鉻酸鉀的硫酸溶液檢定。取在120℃乾燥至恆重的基準重鉻酸鉀約60mg，精密稱定，用0.005mol/L硫酸溶液溶解並稀釋至1000ml，在規定的波長處測定並計算其吸收係數，並與規定的吸收係數比較，應符合表中的規定。（）中未顯示公式。

3.雜散光的檢查

可按下表所列的試劑和濃度，配製成水溶液，置1cm石英吸收池中，在規定的波長處測定透光率，應符合表中的規定。

含有雜原子的有機溶劑，通常均具有很強的末端吸收。因此，當作溶劑使用時，它們的使用範圍均不能小於截止使用波長。例如甲醇、乙醇的截止使用波長為205nm。另外，當溶劑不純時，也可能增加干擾吸收。因此，在測定供試品前，應先檢查所用的溶劑在供試品所用的波長附近是否符合要求，即將溶劑置1cm石英吸收池中，以空氣為空白（即空白光路中不置任何物質）測定其吸光度。溶劑和吸收池的吸光度，在220～240nm 範圍內不得超過0.40，在241～250nm範圍內不得超過0.20，在251～300nm範圍內不得超過0.10，在300nm以上時不得超過0.05。

測定時，除另有規定外，應以配製供試品溶液的同批溶劑為空白對照，採用1cm的石英吸收池，在規定的吸收峰波長±2nm以內測試幾個點的吸光度，或由儀器在規定波長附近自動掃描測定，以核對供試品的吸收峰波長位置是否正確，除另有規定外，吸收峰波長應在該品種項下規定的波長±2nm以內，並以吸光度最大的波長作為測定波長。一般供試品溶液的吸收度讀數，以在0.3～0.7之間為宜。儀器的狹縫波帶寬度宜小於供試品吸收帶的半寬度的十分之一，否則測得的吸光度會偏低；狹縫寬度的選擇，應以減小狹縫寬度時供試品的吸收度不再增大為準，由於吸收池和溶劑本身可能有空白吸收，因此測定供試品的吸光度后應減去空白讀數，或由儀器自動扣除空白讀數后再計算含量。

當溶液的pH值對測定結果有影響時，應將供試品溶液的pH值和對照品溶液的pH值調成一致。

1.鑒別和檢查分別按各品種項下規定的方法進行。

2.含量測定一般有以下幾種方法。

（1）對照品比較法

按各品種項下的方法，分別配製供試品溶液和對照品溶液，對照品溶液中所含被測成分的量應為供試品溶液中被測成分規定量的100%±10%，所用溶劑也應完全一致，在規定的波長測定供試品溶液和對照品溶液的吸光度后，按下式計算供試品中被測溶液的濃度∶

c=（A/A）c

式中c為供試品溶液的濃度；

A為供試品溶液的吸光度；

c為對照品溶液的濃度；

A為對照品溶液的吸光度。

（2）吸收係數法

按各品種項下的方法配製供試品溶液，在規定的波長處測定其吸光度，再以該品種在規定條件下的吸收係數計算含量。用本法測定時，吸收係數通常應大於100，並注意儀器的校正和檢定。

（3）計算分光光度法

計算分光光度法有多種，使用時應按各品種項下規定的方法進行。當吸光度處在吸收曲線的陡然上升或下降的部位測定時，波長的微小變化可能對測定結果造成顯著影響，故對照品和供試品的測試條件應儘可能一致。計算分光光度法一般不宜用作含量測定。

（4）比色法

供試品本身在紫外-可見光區沒有強吸收，或在紫外光區雖有吸收但為了避免干擾或提高靈敏度，可加入適當的顯色劑，使反應產物的最大吸收移至可見光區，這種測定方法稱為比色法。

用比色法測定時，應取數份梯度量的對照品溶液，用溶劑補充至同一體積，顯色后，以相應試劑為空白，在各品種規定的波長處測定各份溶液的吸光度，以吸光度為縱坐標，濃度為橫坐標繪製標準曲線，再根據供試品的吸光度在標準曲線上查得其相應的濃度，並求出其含量。

也可取對照品溶液與供試品溶液同時操作，顯色后，以相應的試劑為空白，在各品種規定的波長處測定對照品和供試品溶液的吸光度，按上述（1）法計算供試品溶液的濃度。

除另有規定外，比色法所用空白系指用同體積溶劑代替對照品或供試品溶液，然後依次加入等量的相應試劑，並用同樣方法處理製得。