分子診斷

應用分子生物學方法檢測患者體內遺傳物質的結構或表達水平的變化而做出診斷的技術，稱為分子診斷。分子診斷是預測診斷的主要方法，既可以進行個體遺傳病的診斷，也可以進行產前診斷。分子診斷的材料包括DNA、RNA和蛋白質。

分子診斷的主要技術有核酸分子雜交、聚合酶鏈反應和生物晶元技術。

1.核酸分子雜交技術具有一定互補序列和核烯酸單鏈在液相或固相中按鹼基互補配對原則締合成異質雙鏈的過程，稱為核酸分子雜交。雜交的雙方是待測核酸序列和探針序列。應用該技術可對特定DNA或RNA序列進行定性或定量檢測。

2.聚合酶鏈反應(即lymerase chain reaction，PCR) 原理：PCR是模板DNA，引物和四種脫氧核糖核昔三磷酸(dNTP )在DNA聚合酶作用下發生酶促聚合反應，擴增出所需目的DNA。包括三個基本步驟：雙鏈DNA模板加熱變形成單鏈(變性)；在低溫下引物與單鏈DNA互補配對(退火)；在適宜溫度下TapDNA聚合酶催化引物沿著模板DNA延伸。

3.生物晶元技術是近年發展起來的分子生物學與微電子技術相結合的核酸分析檢測技術。最初的生物晶元技術主要目標是用於DNA序列測定、基因表達譜鑒定和基因突變體檢測和分析，所以又稱為DNA晶元或基因晶元技術。由於目前這一技術已擴展至免疫反應、受體結合等非核酸領域，出現了蛋白質晶元、免疫晶元、細胞晶元、組織晶元等，所以改稱生物晶元技術更符合發展趨勢。

20世紀50年代Watson和Crick提出了DNA雙螺旋結構模型，標誌著分子生物學作為一門獨立學科的誕生，70年代以來，分子生物學已成為生命科學領域最具有活力的學科前沿。由於分子生物學理論和技術方法不斷地被應用於臨床，在疾病和預防、預測、診斷、療效地評價等多方面發揮著愈來愈重要的作用。分子生物學與臨床醫學的廣泛交叉和滲透，產生了一個嶄新的學科方向—分子醫學；70年代末，美國科學院院士美籍華裔科學家Kan等應用液相DNA分子雜交成功地進行了鐮形細胞貧血症的基因診斷，標誌著檢驗診斷進入基因診斷時代，由於基因診斷是從疾病基因或與致病相關的基因及其表達產物的水平上進行檢測，因此實現了疾病的早期診斷，但由於基因診斷方法以現代分子生物學技術為基礎並有機整合了細胞學、遺傳學等技術，使基因診斷更具有先進性，精確性和快速，因此大大提高了診斷的特異性和靈敏度。

長期以來，疾病的診斷主要依據病史、癥狀、體征和各種輔助檢查，如血液學、病理學、免疫學、微生物學、寄生蟲學乃至物理學檢查等。然而，上述檢查方法都具有其各自的局限性，使得許多疾病未能被及時準確地診斷，從而延誤了治療良機。因為許多外科疾病在病人出現癥狀、體征及生化改變之前就已存在相當一段時間，所以人們一直在盼望能找到一種技術，在疾病一旦發生，甚至尚未出現癥狀、體征及生化改變之前，就能做出診斷；對於某些可能的致病因素，包括食品、水質、環境中存在的病原體，人們也期望能有簡單準確的方法及時進行檢測。隨著基因診斷技術的不斷改進和日臻成熟，其涉及領域和應用範圍不斷擴大，特別是80年代中期聚合酶鏈反應（PCR）技術的問世以及90年代初人類基因組計劃的啟動，進一步推動了基因診斷技術的發展。分子生物學技術的發展使人們渴望已久的上述願望得以實現，1999年11月，美國研究病理學會和分子病理學協會創刊出版了《The Journal of Molecular Diagnostics》雜誌，標誌著這種在分子生物學理論和技術發展基礎上建立起來的一門全新的診斷技術已經發展成為一個成熟的學科——分子診斷學。

回顧分子診斷學20餘年的發展歷史，大致經歷了3個階段：

（1）利用DNA分子雜交技術進行遺傳病的基因診斷；

（2）以PCR技術為基礎的DNA診斷，特別是定量PCR和實時PCR的應用，不僅可以檢測存在於宿主的多種DNA和RNA病原體載量，還可檢測多基因遺傳病細胞中mRNA的表達量。

（3）以生物晶元（biochip）技術為代表的高通量密集型檢測技術，生物晶元技術包括基因晶元，蛋白質晶元，組織晶元等，由於其工作原理和結果處理過程突破了傳統的檢測方法，不僅具有樣品處理能力強、用途廣泛、自動化程度高等特點，而且具有廣闊和應用前景和商業價值，因此成為分子診斷技術領域的一大熱點。

分子診斷學的發展歷史已揭示了其發展方向：

1）分子診斷的內容從傳統的DNA診斷髮展到核酸及其表達產物（mRNA、蛋白質）的全面診斷；

2）分子診斷的策略從利用分子雜交、PCR等單一技術的診斷髮展到有機組合多項技術的聯合診斷；

3）分子診斷的方法從定性診斷髮展到半定量和定量診斷，核酸標記技術，特別是熒游標記技術的發展，熒光定量PCR技術等方法日益成熟；

4）分子診斷的範圍從單基因疾病（門德爾遺傳性疾病，諸如白血病、早老症、血紅蛋白病、甲型肝炎病毒，人類免疫缺陷病毒，人乳頭瘤病毒等）的診斷髮展到多基因病（腫瘤、心腦血管疾病、代謝病、神經系統疾病、自身免疫性疾病等）的診斷；

5）分子診斷的應用多治療性診斷髮展到預防性分析評價，特別是針對高危人群進行疾病基因或疾病相關基因的篩查。

合理的標本採集對保證標本的完整性和核酸的定性/定量檢測的準確性是至關重要的。標本應嚴格按照適當的生物安全指南進行採集，不合適的標本處理會導致核酸降解，產生錯誤的患者檢測結果。

1. 標本識別

標本採集時應明確患者身份及其標本，充分尊重患者隱私。同時應為醫療人員提供合理而充足的檢測和治療相關的信息。標本應牢固地貼上標籤，內容至少包括：識別號、採集日期和時間、標本採集者姓名、標本來源等。

2. 申請單信息

申請單至少包括以下幾點信息：標識號、入院登記號、患者姓名、出生日期、性別、種族、採集日期、標本類型、相關的臨床和實驗室信息、醫生姓名、標本採集的部門、檢測申請原因等。

3. 標本採集

採集人體組織或體液標本時應遵守相關的安全防範措施，佩戴手套，預防標本中血源性病原體的傳播，同時阻止標本被處理人員的脫落細胞污染。特定的檢測方法可能需要額外的預防措施和採集說明，如HPV檢測採集宮頸標本應在醋酸試驗之前。實驗室採用不同的檢測方法時應考慮潛在的干擾和污染來源，正確指導和培訓臨床醫生按照特定方法或檢測體系的標本採集要求進行採集。臨床實驗室收到標本后應儘快將標本信息輸入至實驗室信息系統（LIS），同時應儘快處理接收的標本。如果標本存在如溶血、冰凍血液或標記不當等情況應考慮拒收。

4.抗凝劑

血液和骨髓穿刺（BMA）標本採集應使用合適的抗凝管或含其他添加劑的試管。試管添加劑的選擇應根據分析物類型、試驗、標本量而定，有研究表明肝素和亞鐵血紅素可能會抑制PCR反應。因此，推薦使用EDTA和ACD抗凝劑檢測血漿或骨髓穿刺標本。如果被測量為細胞內RNA，採集血液或骨髓的設備應包含RNA穩定劑，或者在採集后立即加入RNA穩定溶液。

5. 組織標本

如果無法獲得血液或口腔黏膜細胞（如患者死亡），或者組織標本的基因型同血液或口腔黏膜細胞不同，或者組織為某些潛在感染物質核酸的來源時，可採用組織標本。通常最佳的組織量為1-2g，但由於各種組織所含的DNA和RNA的量不同，採集組織的量也因組織而異。多細胞組織如骨髓、淋巴結、脾適用於基因組DNA檢測，需要的組織量較少。少細胞標本如肌肉、纖維、脂肪組織不是基因組DNA的最佳來源，採集量最好大於1-2g。通常，如果沒有廣泛脂肪浸潤，大於10mg的組織至少獲得10μg的RNA或DNA。不同組織的蛋白質的量和類型各不相同，核酸分離方法也因組織而異。按照特定來源的組織，根據廠家建議分離DNA或RNA。

病理科醫生通常從大塊組織中採取有代表性的部分組織進行固定、染色、顯微鏡檢測和病理診斷，或者選擇有代表性的組織提取DNA或RNA進行分子學分析。一般選擇病灶組織進行檢測、非病灶組織作為對照。對照組織對某些分子檢測是至關重要的，如雜合性缺失分析或微衛星不穩定性試驗。

分子診斷是當代醫學發展的重要前沿領域之一，其核心技術是基因診斷，常規技術包括：

（1）聚合酶鏈式反應（PCR）；

（2）DNA測序（DNA sequencing）；

（3）熒光原位雜交技術（FISH）；

（4）DNA印跡技術（ DNA blotting ）；

（5）單核苷酸多態性（SNP）；

（6）連接酶鏈反應（LCR）；

（7）基因晶元技術（gene chip）。

大部分分子診斷實驗室的核心技術都主要集中在檢測特異性、相對較短的DNA或RNA片段上。該技術能診斷傳染性疾病、鑒別影響藥物代謝的特殊基因變異型或檢測與疾病有關的基因，如與癌症有關的基因。這些檢測的核心是實時定量聚合酶鏈反應（PCR）、轉錄調節擴增（TMA）、靶向擴增和信號擴增等類似技術的應用。桑格排序和DNA片段分析或採用毛細電泳法的凝膠法都是分子診斷實驗室的關鍵技術，但他們通常還包括檢測過程中的擴增步驟。為了能順利應用那些採用DNA和RNA來診斷疾病的檢測，分子診斷實驗室必須要使用定義明確的工作流程，從而得到穩定的、有效的結果，而當前已存在能幫助診斷實驗室實現每個工作流程流水化的特殊工具。

檢測的基本流程如下所示：

1、樣本收集和製備。從樣本中提取出用於檢測的基因。

2、擴增：一旦分離出基因物質，必須立即將其擴增到可檢測數量，以便做出診斷命令。

3、檢測：獲得足夠的目標物質后，光型感測器將讀取與即將檢測的目標物質相對應的信號。信號必須是單一的或多樣的，從而實現一次反應（如多通道檢測）中檢測到多種目標物質。

4、數據分析：對在檢測步驟中讀取出的信號進行分析。將分析結果轉換為實驗室人員隨時可以解釋的信息，從而最終為臨床醫生提供診斷結果。

其中，PCR產品佔據分子診斷的主要市場，基因晶元是分子診斷市場發展的主要趨勢。PCR產品靈敏度高、特異性強、診斷窗口期短，可進行定性、定量檢測，可廣泛用於肝炎、性病、肺感染性疾病、優生優育、遺傳病基因、腫瘤等，填補了早期免疫檢測窗口期的檢測空白，為早期診斷、早期治療、安全用血提供了有效的幫助。基因晶元是分子生物學、微電子、計算機等多學科結合的結晶，綜合了多種現代高精尖技術，被專家譽為診斷行業的終極產品。但其成本高、開發難度大，產品種類很少，只用於科研和藥物篩選等用途。

世界各國高度重視分子診斷技術的發展，基因晶元將成為新一代分子診斷試劑開發的主流。基因晶元是分子生物學、微電子、計算機等多學科結合的結晶，綜合了多種現代高精尖技術，被專家譽為“診斷行業的終極產品”。基因晶元具有同時能夠檢測多個靶點的功能，具有快速有效的特點。因而基因晶元成為新一代分子診斷試劑的主要開發方向，但其成本高、開發難度大，產品種類很少，只用於科研和藥物篩選等用途。基因晶元的大規模臨床應用還存在尚未克服的技術缺陷，主要是由於晶元診斷特異性和靈敏度低、晶元診斷成本高昂和晶元診斷配套儀器價格昂貴等原因。全球，雖然只有少數的晶元可用於臨床診斷，但國內基因晶元技術已經處於世界領跑的地位。基因晶元技術將是熒光定量PCR 檢測技術最具挑戰的潛在對手，主要是：熒光定量PCR 技術一次只能檢測一個或幾個目標基因，而基因晶元技術可以實現對大量目標基因的同時檢測。隨著人類基因組計劃的進展，基因晶元在國內外已成為研發熱點。若基因晶元技術迅速成熟並大規模產業化，將對熒光定量PCR 檢測產生較大的衝擊。預計熒光定量PCR 檢測技術在今後5 到10 年內可保持領先。