APOA-Ⅱ

載脂蛋白AⅡ

APOA-Ⅱ

血液生化檢查 > 脂類測定

（1）免疫透射比濁法的原理是：血清載脂蛋白AⅡ與試劑中的特異性抗人載脂蛋白AⅡ抗體相結合，形成不溶性免疫複合物，使反應液產生混濁，以光度計在波長340nm測出吸光度，代表混濁程度，濁度高低反映血清標本中載脂蛋白AⅡ的含量，後者可由校準血清所作校準曲線讀出。

試劑中聚乙二醇（PEG）有促進抗原抗體反應的作用。載脂蛋白AⅡ主要存在於HDL顆粒表面，血清稀釋及表面活性劑有助於HDL 載脂蛋白AⅡ抗原位點的暴露，使之能充分地與特異性抗體起反應，表面活性劑還可減輕血清空白濁度。

（2）火箭電泳法的原理是：火箭免疫電泳法是單向免疫擴散法的一種改進，通過應用直流電（穩壓穩流）使抗原（載脂蛋白AⅡ和B）在含有特異性抗體的瓊脂糖凝膠中擴散，pH 8.6時抗原向陽極移動，在泳動途中與凝膠中的抗體反應，逐漸形成類似火箭的沉澱峰。其峰高（或峰面積）與抗原濃度成正比，故可作抗原定量。

（1）免疫透射比濁法：

①樣品稀釋劑：pH 7.4的磷酸鹽緩衝液（0.01mol/L磷酸鹽中含0.15mol/L氯化鈉），內含PEG-6000 40g/L及表面活性劑適量（選用聚氧乙烯月桂醚類，如Thesit或Tween-20），用GS玻芯漏斗抽濾後用。本試劑的吸光度A340nm<0.05，在2～6℃冰箱中可存放半年。如半年後A值仍0.05可按上述條件抽濾后再用。

②羊或兔抗人載脂蛋白AⅡ抗血清：原血清效價以1∶32～1∶64為宜。抗血清可用含PEG-6000的磷酸鹽緩衝液（不含表面活性劑）或用硫酸銨沉澱法純化。抗血清應用液濃度因各批抗血清的效價及免疫親和力而異（應按試劑盒說明書，臨用前稀釋）。抗血清中含防腐劑，在2～6℃冰箱中可存放半年。原血清（凍干）在低溫冰箱中（－20℃以下）可貯存數年。

③參考血清：現在已有國際標準，即WHO 載脂蛋白AⅡ參考物質SPI-01（凍干血清）。符合國際標準的校準血清由衛生部北京老年醫學研究所提供。

校準血清保存在－20℃以下，至少穩定半年，化凍后必須徹底混勻后才能應用。最好備有高、中、低濃度（例如apoA-Ⅰ 2.0，1.3與0.6g/L左右）的校準血清各1份。便於作校準曲線。

（2）火箭電泳法：

①巴比妥緩衝液，離子強度0.05，pH8.6。

②10g/L瓊脂糖（標準電內滲）用巴比妥緩衝液配製，加熱溶化，混合后，分裝10ml/管，冷后4℃貯存。

③0.15mol/L NaCl溶液。

④兔（或羊）抗人apoA-Ⅰ抗血清（效價不低於1∶16）及apoB抗血清（效價不低於1∶32）。

⑤校準血清（同比濁法）。

⑥染色液：考馬斯亮藍R-250 0.25g溶於甲醇45ml中，加入冰醋酸10ml及水45ml，混合，溶後備用。

⑦脫色液：每升含冰醋酸50ml及甘油100ml。

（1）免疫透射比濁法：

①標本應是及時分離的空腹血清，可密封存放在2～6℃冰箱中，1周內測定，－20℃可存放半年。

②用全自動分析儀時，應根據不同儀器設計參數，合理選擇抗原抗體比例及反應時間。也可作速率法散射比濁測定載脂蛋白AⅡ如用Beckman比濁儀ICS或protein array system）。

③手工法所用儀器：精密光度計，具有340nm濾光片（或分光器），樣品池體積以0.5ml為宜（為節省抗血清），最好用流動杯，樣品稀釋最好用稀釋器、經校正的加樣器。

④標本處理：將血清標本及質控血清各用樣品稀釋劑作1∶200稀釋，即先作1∶20稀釋（5.Oμl血清+95μl稀釋劑）后，再作1∶10稀釋（多餘的1∶20血清作測定apoB用）。然後按表1操作。

質控同上處理。

混勻后，25～37℃放置30min，在波長340nm比濁，根據U-UB的A值，在標準曲線上讀出結果。

本法批間CV<5%。

⑤校準曲線：在手工與半自動操作中每批測定均需作校準曲線，可將校準血清稀釋成1∶100、1∶200、1∶300和1∶400等4種濃度，與標本同樣操作，根據定值計算出每個標準管載脂蛋白AⅡ濃度，以濃度（X）與其相應的A值（Y）作圖（用直線回歸計算），基本上成直線，但在Y軸上有一定截距，所以不能用單點標準。操作準確時濃度與A值的相關係數應在0.985以上。

如有高、中、低濃度的三份校準血清時，可與標本同樣操作，做三點定標，也可作五點定標（即高、中濃度的血清等量混合，及中、低濃度的血清等量混合，成為另兩份校準血清）。

本法線性範圍：0.4～2.5g/L。

（2）火箭電泳法：

①澆板：每板用10g/L瓊脂糖10ml，沸水浴中融化，混勻，冷至50～55℃時加入載脂蛋白AⅡ抗血清50μl，apoB抗血清8μl（用量視抗血清效價而定），迅速混勻后倒在預置在水平台上的玻璃板上，冷後放在4℃，20min后打孔，孔在板的陰極端，孔徑3mm，孔間距至少5mm，孔容量5μl。把板放入電泳槽，用濾紙搭橋。

②稀釋抗原：用0.15mol/L NaCl液將校準血清稀釋成1∶100，1∶150，1∶200，1∶300，及1∶400（作校準曲線之用），血清標本按1∶200稀釋，放4℃冰箱不得超過3天。

③加樣：在低電流狀態（10mA/板）將稀釋好的定值血清及標本分別吸取5μl（準確），加入瓊脂糖凝膠加樣孔內。每板都要做一系列標準。

④通電：穩流24mA/板，端電壓6～8V/cm，以流水冷卻使瓊脂糖保持15℃，電泳3～4h。

⑤脫雜蛋白及制干膠膜：電泳后的瓊脂糖板浸泡在0.15mol/L NaCl中30min，將膠膜托置於聚酯薄膜上，用多層濾紙在輕輕加壓下吸干膠內水分，然後將濾紙、膠膜與聚酯膜三者一起自然乾燥，或用熱吹風器吹乾，干后膠膜會自然與濾紙及聚酯膜分開。

⑥染色：將瓊脂糖膠膜平鋪浸泡於染色液內20～30min。

⑦脫色：用脫色液浸泡已染色的膠膜至火箭峰清晰，背景基本無色。可在水中用兩片玻璃紙將膠膜夾住，晾乾后可長期保存。也可以用流水浸泡脫色至背景乾淨。

250～520mg/L。

降低：冠心病、糖尿病、腎病綜合征、遺傳性ApoA-Ⅰ缺乏症（Tangier病）、家族性低α-脂蛋白血症、魚眼病、重度營養不良、肝炎活動期、肝功能低下。

（1）免疫透射比濁法：

①關於抗血清：比濁測定與其他方法相比對抗血清的要求更高。比濁法以用多克隆抗體為宜。抗血清中必須不含雜抗體。必須十分重視從人血清中提取的載脂蛋白AⅡ達到免疫純、色譜純與電泳純，這不是一般實驗室都能做到的。抗血清效價（滴度）不可低於16。目前國內某些商品試劑中，載脂蛋白AⅡ抗血清效價極低，選購試劑盒時必須注意。如果沒有在選購前鑒定抗血清質量的經驗，應請有條件的單位鑒定之。

②上法中標本（血清）稀釋200倍是為了便於手工操作（加樣100μl），如有精密加樣器，可作20倍稀釋（用10μl）。為了適合不同實驗室的條件（如不同類型的自動化儀器），作適當修改時應注意抗原抗體的比例，必須十分注意反應體系中不可有抗原過量，線性上限不可低於2.5g/L。換言之，抗血清用量必須充裕，否則標本中apoA-Ⅰ高水平時測出結果偏低。目前國內某些商品試劑盒不但抗血清效價過低，操作中所定標本用量又過大（如3～5μl），抗體明顯不足，測出結果必然不準確。

③為了達到準確測定的目的，載脂蛋白AⅡ與B比濁測定（終點法）中必須作校準曲線計算結果。一定範圍（低標本用量）濃度（X）與濁度（Y）基本上成直線關係，直線回歸計算出在Y軸上有一定截距（A值<0.1），所以用單點校準計算結果偏差較大，使測出結果不能準確反映濃度的高低（高的偏低，低的偏高）。千萬不要因為單點法簡便而忽略了測定的準確性。無論用何種自動化儀器，必須先試作校準曲線。如果在所用儀器及特定條件下反覆測試，回歸線的截距不明顯時，才能採用單點校準法。標本用量在3～5μl時，即使加大抗血清用量，濃度與濁度也不成直線關係，只能用曲線直線化轉換後計算。

④主要干擾因素是血清本身的混濁（如高脂血清），用超離心或脂肪酶水解等標本預處理方法都不實用。用表面活性劑消濁的作用也有限，所以在測定中必須作標本空白管。除了自動分析中可採用兩點法外，手工法用單一試劑而不扣除標本空白的做法是錯誤的。為了減少基質效應對濁度反應的影響，必須用定值血清作校準物。此外，塵埃粒子、比濁皿划痕等干擾也必須排除。

⑤有的商品試劑盒（包括某些進口產品）所附校準血清定值不準確，是誤差的重要來源。

（2）火箭電泳法：

①抗原稀釋倍數與抗血清用量的選擇，應以火箭峰清晰、校準曲線斜率適中並成直線為宜。本法同時測定載脂蛋白AⅡ與apoB，應調整兩種抗血清用量，使二者峰高有區別，apoB峰高不小於1cm。

②不同種類來源的抗血清（如兔與羊），在等效價的情況下進行試驗，結果會有差異。apoA-Ⅰ測定以兔抗血清為好。用兔血清時峰形尖細，而羊血清所產生的峰粗，峰尖圓鈍，有時在峰頂前出現虛影。校準血清所作校準曲線斜率也不同。但不論用何種抗血清，定量結果差別不大。

③在一定條件下電泳，不同稀釋度校準血清的峰高不會有明顯變動，校準曲線斜率基本一致。如標本峰高超出校準曲線範圍時，應調整標本稀釋倍數后重測。板間CV通常小於5%。

④火箭電泳結果可以用染色法或直接肉眼觀察可見的火箭峰。前者用標本少，節省抗血清，但如適當增加標本及抗血清用量，不染色更為方便。所用瓊脂糖應為標準電滲或低電滲的，凝膠中加入適量葡聚糖或聚乙二醇可使火箭峰更清晰。

⑤火箭峰的測量可以計算面積或峰高，面積是峰高乘以峰寬（峰半高處的寬度）。測量精度最好能達0.1mm。須用機械或電子放大設備。標準曲線範圍內峰高以1～4cm為宜。

⑥本法適用於少量標本分析。也適用於apoAⅡ、CⅠ、CⅡ、CⅢ、D、E及Lp（a）測定。

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血漿脂蛋白