疏水作用

1959年，Kauzmann在《蛋白質化學進展》上發表了一篇題為“影響蛋白質變性的一些因素”的文章，首次明確提出“疏水作用”這一概念。在當時，生物化學家已經知曉蛋白質中含有α螺旋和β摺疊；一些蛋白質和多肽的序列已經測定；但是蛋白質的立體結構還正在測定中。

與此同時，Tanford等為疏水作用的存在提供了實驗數據。從此以後，疏水作用的概念被蛋白質化學家所接受。目前，不同實驗室對20種氨基酸的疏水特性分別提出了不同的參數。對一個蛋白質肽鏈中的每個氨基酸殘基也通常使用親/疏水作圖法（hydropathy）描述。通過親/疏水作圖法可以了解整條肽鏈中不同肽段的親/疏水性，進而可以對一些處於蛋白質分子表面的抗原決定簇及一些膜蛋白中穿越膜的肽段進行預測。

隨著越來越多的蛋白質的晶體結構被解析，對蛋白質立體結構的一般規律也日益清楚。

就一個球狀蛋白質而言，它們的表面常被一層親水殘基包圍，帶有疏水側鏈的殘基原則上處於分子內部，但並不是絕對的。嚴格地說，整個蛋白質分子由里到外，疏水殘基是逐漸減少，親水殘基則不斷增多。比較而言，親水殘基出現在分子內部的幾率大於疏水殘基出現在分子表面的幾率。因為很多帶有電荷的殘基通過正負電荷的相互作用而形成鹽鍵，或者是一些殘基的側鏈參與氫鍵的形成，結果削弱了殘基的親水性，使某些側鏈的疏水性質更為突出。又例如肽鏈骨架中肽鍵內的羰基和亞胺基都有親水和形成氫鍵的特性。球狀蛋白質表面也存在著一些疏水殘基，從能量上看，是處於不穩定狀態，它們有變得更為穩定的傾向。這些殘基的側鏈往往成為蛋白質的活性位點，參與和其它分子的相互作用；或是參與亞基和亞基的相互作用，形成蛋白質的四級結構，或是自身、或是和其它分子締合。

就膜蛋白而言，其肽鏈中穿越膜的肽段經常是形成兩親性α螺旋或β摺疊。它們一個側面集中了較多的疏水性殘基，相對的另一側面存在著不少親水性殘基。有些膜蛋白具有多個穿越膜的肽段，這些肽段形成的兩親螺旋的疏水面向著膜脂質中的脂肪鏈，親水面則背對脂肪鏈，並且還以特定的方式排列，儘可能地避免和疏水環境接觸，同時相互協同形成某種親水的微環境。有些一次穿越膜的蛋白質也往往表現出有形成二聚或多聚化的傾向，其結果也是使穿越膜的肽段在能量上更為穩定。

綜上所述，蛋白質結構的特徵是疏水/親水間的平衡，其結構的穩定在很大程度上有賴於分子內的疏水作用。當然，穩定蛋白質結構的因素不僅是疏水作用，還有氫鍵、鹽鍵和范德華力以及肽鏈內的二硫鍵、肽鏈和所含金屬元素間的配位鍵等。但是從各種因素的貢獻看，疏水作用是最重要的。

疏水作用的本質來源於熵力，一個孤立系統出現平衡態是熵和能量兩方面達到最佳折衷的產物。考茲曼（W.Kauzmann）1959年指出為了減少暴露在水中的非極性表面積，任何兩個在水中的非極性表面積將傾向於結合在一起。疏水溶劑化的代價大部分源於熵，疏水效應顯著的熵特性，這暗示著隨溫度增高疏水效應的增強（前提是溫度不得破壞水中氫鍵的情況下，氫鍵破壞越多疏水表面對氫鍵形成干擾越小，疏水效應減弱）。與排空效應是類似的疏水效應能夠利用熵呈現出分子的自組裝。

非極性溶劑、去污劑可以破壞疏水相互作用，而高鹽溶液增大疏水作用力，使蛋白溶解度下降出現鹽析，常用於蛋白質沉澱。另外生物分子不同的疏水基團作用力不同，利用這個性質通過改變洗脫液的鹽-水比例（改變離子強度）而改變其極性，使極性不同的組分根據疏水性的差異先後被解析下來達到分離的目的，這又被稱為疏水層析法。簡單的說就是“高鹽吸附、低鹽洗脫”，這是一種常用的蛋白質分離提純方法。尿素、鹽酸胍既能破壞氫鍵又能破壞疏水作用因此是蛋白質的強變性劑。

排空效應：當大顆粒被半徑為R的小顆粒包圍時，小顆粒能把大顆粒推到一起，以使小顆粒自身的熵最大。如果兩個表面精確匹配，則相應的單位接觸面積上的自由能減少為：ΔF/A=ckBT×2R，ckBT是平衡滲透壓的范特霍夫關係，c=N/V是溶質分子數密度，kB為玻爾茲曼常數，T為溫度。疏水作用比起其他3個次級鍵，目前還未找到比較有效的計算方法，主要是模擬水和有機溶劑中的溶質，通過轉移自由能ΔG來計算分配係數LogP。

ΔG液體→水溶液=－RTln（Xaq/Xliq），Xaq、Xliq是水溶液和與之接觸非極性液體平衡濃度。

在對蛋白質立體結構有所了解的基礎上，蛋白質化學家很自然地希望闡明蛋白質立體結構是如何形成的，即肽鏈是如何摺疊的。

從Anfinsen經典的核糖核酸酶的還原和重氧化實驗，得出蛋白質肽鏈摺疊的基本原則：蛋白質的氨基酸序列決定了蛋白質的立體結構，即肽鏈的摺疊方式。肽鏈摺疊的本質，可以簡單地理解為將肽鏈中絕大多數的疏水殘基包裹到分子內部。這種包裹或是說摺疊，卻不是任意的。一條肽鏈可以有無數種可能的摺疊方式——空間構象，但最終形成的是有活性的特定構象。

從蛋白質變性研究了解到，肽鏈鬆散是一個快速過程，變性后肽鏈在合適條件下的再摺疊基本上是變性的逆過程，同樣也是十分快速的。目前對摺疊過程，基本上有2種不同的假設。一種假設認為，肽鏈中的局部肽段先形成一些構象單元即α螺旋、β摺疊和β轉角等二級結構，然後再是二級結構的組合、排列形成蛋白質的三級結構；另一種假設認為，首先是肽鏈內部的疏水作用起作用，產生一個塌陷過程，然後經調整，形成不同層次的結構。儘管是不同的假設，但是很多學者都認為有一個所謂“熔球態”的中間狀態。在熔球態中，蛋白質的二級結構已基本形成，蛋白質的整體空間結構也初具規模。在熔球態時，分子立體的結構再作一些局部調整，最後形成正確的立體結構。這些局部調整可以理解為內部一些殘基之間的疏水/親水平衡的“完善”。就糖蛋白而言，整個蛋白質立體結構的形成和糖基化也有一定關係。糖殘基或糖鏈是親水性較強的基團，加到肽鏈上明顯地改變了分子的疏水/親水平衡。

近年來，對蛋白質的新生肽鏈在體內的摺疊研究已成為一個熱點，發現了許多幫助肽鏈摺疊的蛋白質，其中有些有利於二硫鍵的交換和配對（二硫鍵異構酶）與脯氨醯參與的肽鍵的異構化（肽基脯氨醯異構酶），還有一大類被稱為蛋白質伴侶。後者的主要特點是能和疏水性的肽段結合，一方面避免肽鏈因疏水作用而聚集，另一方面幫助新生肽鏈形成正確的空間構象。對一些具有四級結構的蛋白質，蛋白質伴侶還幫助了亞基間的裝配。在胞質中有些蛋白質伴侶是由2種亞基構成的多聚體，其外形猶如帶有蓋的圓桶，其效果如有魔法的桶，鬆散的新生肽鏈進入，出來的便是有特定空間構象的蛋白質。

在細胞質中合成的新生肽鏈，有相當一部分被傳送並定位到細胞內的不同細胞器上，或被分泌到細胞外。摺疊成為特定空間構象的肽鏈，表面帶有大量的親水基團，雖然在細胞質中很容易被傳送，但是不能通過脂質構成的細胞器膜。因此，定位在一些細胞器（例如線粒體）上的蛋白質，其新生肽鏈合成后，往往是和某種蛋白質伴侶結合，以屏蔽新生肽鏈表面的疏水殘基，便於傳送，一旦到達其定位的細胞器表面，肽鏈和蛋白質伴侶解離，依靠前導的信號肽以及其它一些蛋白質複合體的幫助，或是定位在一些細胞器的膜中，或是通過細胞器膜，進入細胞器的腔內。進入內質網的新生肽鏈，在內質網內的一些（可溶性的或膜結合的）蛋白質伴侶的“質量”監控下，摺疊和組裝為成熟的蛋白質。摺疊不正確的肽鏈和組裝不正確的寡聚蛋白都不能進入高爾基體，因而不能被正確定位到其它細胞器或被分泌到細胞外。最近發現某些脂質分子也可以幫助膜蛋白肽鏈的摺疊，起到蛋白質伴侶的作用。這更說明，只要能降低肽鏈間的疏水作用而使它們不能聚集的分子，不論是蛋白質還是脂質，都有可能幫助肽鏈摺疊形成正確的構象，都可成為蛋白質伴侶。

在體液中，一些疏水的分子輸送非常困難。所幸的是，在體液中存在著多種這些疏水分子的運載蛋白。不僅有各種不同的載脂蛋白以專一性較廣的方式運輸著不同的脂質類分子（包括脂肪、膽固醇等），而且還有一些非常專一的運載蛋白負責著一些特殊疏水分子的運輸，如維生素B12結合蛋白、視黃醇/甲狀腺素運載蛋白（transthyretin）等。同樣，親水分子通過質膜，一定要越過能障。可欣慰的是，質膜中存在著不同類型的離子和分子通道。它們是通過膜蛋白的肽段在質膜中以特定方式排列而成的。如一些神經遞質受體蛋白，多數由幾個亞基組成，每個亞基又分別有螺旋穿越質膜，同時排列成中間親水的通道。最近還發現了水通道蛋白。

介質中球狀蛋白質的摺疊總是傾向與把疏水殘基埋藏在分子的內部，這一現象稱為疏水作用，它在穩定蛋白質的三維結構方面佔有突出地位。疏水作用其實並不是疏水基團之間有什麼吸引力的緣故，而是疏水基團或疏水側鏈出自避開水的需要而被迫接近。

蛋白質溶液系統的熵增加是疏水作用的主要動力。當疏水化合物或基團進入水中時，它周圍的水分子將排列成剛性的有序結構即所謂籠形結構（clathrate structure）。與此相反的過程（疏水作用），排列有序的水分子（籠形結構）將被破壞，這部分水分子被排入自由水中，這樣水的混亂度增加即熵增加，因此疏水作用是熵驅動的自發過程。

目前，和瘋牛病有關的蛋白質PrP被一些學者稱為“朊病毒”。瘋牛病的發生，從分子水平看，是蛋白質分子形態的改變，由原來的單個球狀分子變成了纖維狀的聚集態。此外有2個和早老性痴獃有關的蛋白質，在病變時也發生聚集，它們是β澱粉樣蛋白（Aβ）和Tau蛋白。這些蛋白質在病變時的一個共同特點是，分子中β摺疊增加，進而導致分子聚集，對蛋白水解酶的抗性增大。瘋牛病的發生，既沒有也不需要有DNA複製，也沒有作為病原體的蛋白質增加，因此，將PrP稱為“朊病毒”並不確切。將瘋牛病等有關的疾病稱為蛋白質“構象病”更合適。發生瘋牛病時，PrP中一些α螺旋如何轉變為β摺疊？目前還不太清楚。有人假設很可能存在一種起著去摺疊作用的未知的X蛋白質。最近研究表明，PrP蛋白質中特定肽鍵的斷裂是引起變構的原因。另一方面，關於病變時Aβ和Tau蛋白的聚集的分子機制則有所報道。Aβ是一個前體大分子蛋白質N-端約50個氨基酸殘基構成的肽段，經酶解斷裂后很容易聚集。可能在前體分子中，這段肽和分子內的其它肽段存在著相互作用，故不發生該肽段間的相互作用，一旦從完整分子中遊離出來，就可能和同樣的碎片肽段聚集。

在正常情況下，Tau蛋白分子中有很多絲氨酸和蘇氨酸被單個N-乙醯氨基葡萄糖基化（O-GlcNAc化），但是病變時，同樣的位點不再O-GlcNAc化，而是被磷酸化。表面看來，這2類基團都是親水的，但O-GlcNAc是中性的，而被磷酸修飾后則變為酸性。相鄰的成簇的磷酸基團間的排斥力，可能會導致Tau蛋白的構象改變，致使分子內的相互作用變成分子間的相互作用，最終同樣會形成長的纖維。

因此，蛋白質“構象病”在蛋白質的研究中，絕對不是孤立的現象，完全應該也可能，從疏水作用、親水/疏水平衡的角度，與蛋白質的摺疊、蛋白質的裝配、蛋白質的別構現象聯繫起來進行研究。