elisa試劑盒

免疫測定技術的基礎在於抗原抗體之間的特異結合反應，所以任何優質的診斷試劑離不開優質的原料，如抗原抗體，酶等。以前用於免疫測定的抗原通常為各種純化抗原，而抗體則為純化抗原免疫動物后獲得的多克隆抗體和使用雜交瘤技術得到的單克隆抗體，而抗原或抗體的標記物如酶標結合物則通過各種化學合成方法製備。近年來，隨著分子生物學的發展，使用基因工程方法製備各種特殊的抗原或抗體及其酶結合物等免疫測定試劑幾成為現實的新一代試劑，各種新型使用的測定方法也不斷出現。

HBsAg試劑特點（檢測模式：臨床抗體夾心法）：包被抗體為山羊多抗。多抗具有高親和性和對抗原各種表位的反應性。酶表抗體為與HBsAg有不同結合位點的鼠複合單位，可測得HBsAg變異樣品，提高檢測的特異性（99.98%）提高檢測的靈敏度，應用Parl Ehrich學說（PEI）HBsAg標準品，對ad標準品的靈敏度為0.05ng/ml對ay標準品靈敏度為0.025ng/ml

ELISA檢測試劑盒應用定性夾心免疫檢測技術，用合成的HEV多肽抗原包被微孔板板條，這些多肽是中國型HEV毒株核心氨基酸序列中抗原性很強的肽段，分別來自於該毒株的開放閱讀框2和開放閱讀框3。將樣品或標準品加入孔中並孵育，如果其中存在HEV IgM抗體，這些抗體就會與HEV的多肽抗原結合，並固定在上面，洗板除去其它非特異性抗體和樣品中的其它成份。然後加入羊抗人IgM-HRP（辣根過氧化物酶）酶結合物，經第二次孵育后，酶結合物就會與第一次孵育結合上的HEV IgM抗體相結合，洗板除去未結合的酶結合物，加入TMB底物溶液，在第三次孵育時會發生酶-底物反應，只有那些含有HEV IgM抗體和酶結合物所形成的複合物的孔才會發生顏色變化，加入硫酸溶液終止酶和底物間的反應，並在波長：450nm處測量O.D.值，按照本HEV IgM抗體elisa試劑盒的測試標準，O.D.值大於或等於Cut-Off值的樣品被認為是初試陽性。

ELISA的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。結合在固相載體表面的抗原或抗體仍保持其免疫學活性，酶標記的抗原或抗體既保留其免疫學活性，又保留酶的活性。在測定時，受檢標本（測定其中的抗體或抗原）與固相載體表面的抗原或抗體起反應。用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體複合物與液體中的其他物質分開。再加入酶標記的抗原或抗體，也通過反應而結合在固相載體上。此時固相上的酶量與標本中受檢物質的量呈一定的比例。加入酶反應的底物后，底物被酶催化成為有色產物，產物的量與標本中受檢物質的量直接相關，故可根據呈色的深淺進行定性或定量分析。由於酶的催化效率很高，間接地放大了免疫反應的結果，使測定方法達到很高的敏感度。ELISA可用於測定抗原，也可用於測定抗體。

然而，影響Elisa試驗結果的因素很多，故加強各個環節的質量保證才能充分發揮其方法學的優點。

一、高效、靈敏、特異的抗體；

二、穩定的重複性和可靠性；

三、吸附性能好，空白值低，孔底透明度高的固相載體；

四、適用血清、血漿、組織勻漿液、細胞培養上清液、尿液等等多種標本類型；

五、節省實驗經費。

elisa試劑盒回收率是反應待測物在樣品分析過程中的損失的程度，損失越少，回收率越高，如果作標液1PPM，就是1毫克/升，而作出標準數據為0.99毫克/升，就是說你的回收率是99%，這個與真實成分有密切的關係，說明方法的準確度。比如水中總無機氯含量測定，樣品水中含有無機氯20mg/L，取100mL被測水樣品，加入0.1mL濃度為10mg/mL的含無機氯標準樣品，測定時忽略體積變化，如果測定出樣品中無機氯為2.98mg/L，則認為回收率為99%。

包括以下步驟：

1)抗原表位的計算機篩選；

2)抗原的製備；

3)血清的採集；

4)間接ELISA方法的建立；

5)間接ELISA方法的敏感性和特異性驗證；

6)試劑盒的穩定性驗證；

7)對屠宰場進行臨床檢測。該方法簡單、快速、靈敏度高、特異性強、穩定性合格、重複性好。應用本發明製得的試劑盒能有效檢出感染豬的戊型肝炎病毒，適用於大批量發病樣本的檢測，可用於豬戊肝的快速診斷，並預防、控制豬戊肝病毒的流行和阻斷戊肝病毒由豬向人傳播。

1、血清：操作過程中避免任何細胞刺激。使用不含熱原和內毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細胞迅速小心地分離。

2、血漿：EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用於檢測。1000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細胞上清液：1000×g離心10分鐘去除顆粒和聚合物。

4、組織勻漿：將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g離心10分鐘，取上清液。

5、保存：如果樣品不立即使用，應將其分成小部分-70℃保存，避免反覆冷凍。儘可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應在室溫下解凍並確保樣品均勻地充分解凍。

此IBL試劑盒能用於小鼠血清，EDTA血漿，細胞上清中白介素-6的定量檢測

試劑盒成分

1.預包被板：抗小鼠白介素-6兔子IgG，親合純化 96T

2.酶標記抗體：(30倍濃縮)HRP標記抗小鼠白介素-6兔子IgG，親合純化 0.4mL x 1

3.標準品：重組小鼠白介素-6 0.5mL x 2

4.EIA緩衝液：含1% BSA， 0.05%吐溫20 BPS 30mL x 1

5.標記抗體稀釋液：含1% BSA， 0.05%吐溫20 BPS 12mL x 1

6.顯色劑：TMB底物液 15mL x 1

7.終止液：1N硫酸 12mL x 1

8.濃縮洗滌液：(40倍濃縮)含1%BSA，0.05%吐溫20 BPS 50mL x 1，操作說明1實驗所需器材(但試劑盒沒有提供)酶標儀(450nm)微移液管及其吸嘴量筒及燒杯去離子水冰箱(4°C)坐標紙(log/log)吸水紙試管(用於標準品稀釋)溫育箱(37°C ± 1°C)洗瓶(用於洗板)一次性試劑管(用於濃縮酶標記抗體和顯色劑)。

雙抗體夾心法

1.包被：用0.05MPH9.牰碳酸鹽包被緩衝液將抗體稀釋至蛋白質含量為1～10μg/ml。在每個聚苯乙烯板的反應孔中加0.1ml，4℃過夜。次日，棄去孔內溶液，用洗滌緩衝液洗3次，每次3分鐘。（簡稱洗滌，下同）。

2.　加樣：加一定稀釋的待檢樣品0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時。然後洗滌。（同時做空白孔，陰性對照孔及陽性對照孔）。

3.　加酶標抗體：於各反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標抗體（經滴定后的稀釋度）0.1ml。37℃孵育0.5～1小時，洗滌。

4.　加底物液顯色：於各反應孔中加入臨時配製的TMB底物溶液0.1ml，37℃，10～30分鐘。

5.　終止反應：於各反應孔中加入2M硫酸0.05ml。

6.　結果判定：可於白色背景上，直接用肉眼觀察結果：反應孔內顏色越深，陽性程度越強，陰性反應為無色或極淺，依據所呈顏色的深淺，以“+”、“-”號表示。也可測OD值：在ELISA檢測儀上，於450nm（若以ABTS顯色，則410nm）處，以空白對照孔調零后測各孔OD值，若大於規定的陰性對照OD值的2.1倍，即為陽性。

間接法

1.用包被緩衝液將已知抗原稀釋至1～10μg/ml，每孔加0.1ml，4℃過夜；

2.次日洗滌3次；

3.加一定稀釋的待檢樣品（未知抗體）0.1ml於上述已包被之反應孔中，置37℃孵育1小時，洗滌；

4.（同時做空白、陰性及陽性孔對照）於反應孔中，加入新鮮稀釋的酶標第二抗體（抗抗體）0.1ml；

5.37℃孵育35-60分鐘，洗滌；

6.’最後一遍用DDW洗滌。

其餘步驟同“雙抗體夾心法”的4、5、6。

臨床測定技術的發展主要在於方法學的發展，而方法學的發展依託於試劑生產技術不斷進步更新和型標記物的應用。分子生物學正在並最終肯定會讓對整個生命科學有一個全面而徹底的認識，其對免疫測定技術發展的影響也是直接而又有效的，對以前一些難以檢測的生物活性物質的測定，並且大大提高了檢測的靈敏度和特異性。

試劑

（1）包被緩衝液（PH9.60.05M碳酸鹽緩衝液）:

Na2CO3 1.59克

NaHCO3 2.93克

加蒸餾水至1000ml

（2）洗滌緩衝液（PH7.4PBS）：0.15M

KH2PO4 0.2克

Na2HPO4·12H2O　2.9克

NaCl　8.0克

KCl　0.2克

Tween-20　0.05%　0.5ml

加蒸餾水至1000ml

（3）稀釋液：

牛血清白蛋白（BSA） 0.1克

加洗滌緩衝液至100ml

或以羊血清、兔血清等血清與洗滌液配成5～10%使用。

（4）終止液（3M　H2SO4）：

蒸餾水178.3ml，逐滴加入濃硫酸（98%）21.7ml。

（5）底物緩衝液（PH5.0磷酸棗檸檬酸）:

0.2MNa2HPO4（28.4克/L）25.7ml

0.1M檸檬酸（19.2克/L） 24.3ml

加蒸餾水50ml。

（6）　TMB（四甲基聯苯胺）使用液:

TMB（10mg/5ml無水乙醇）0.5ml

底物緩衝液（PH5.5） 10ml

0.75%H2O2 32μl

（7）　ABTS使用液:

ABTS　0.5mg

底物緩衝液（PH5.5） 1ml

3%H2O2 2μl

（8）抗原、抗體和酶標記抗體。

（9）正常人血清和陽性對照血清。

器材

（1）聚苯乙烯塑料板（簡稱酶標板）40孔或96孔，ELISA檢測儀，50μl及100μl加樣器，塑料滴頭，小毛巾，洗滌瓶。

（2）小燒杯、玻璃棒、試管、吸管和量筒等。

（3）　4℃冰箱，37℃孵育箱。

試驗原理

試劑盒是固相夾心法酶聯免疫吸附實驗（ELISA）.已知濃度的標準品、未知濃度的樣品加入微孔酶標板內進行檢測。先將生物素標記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標記過的HRP。再經過溫育和洗滌，去除未結合的酶結合物，然後加入底物A、B，和酶結合物同時作用。產生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關係。

自備材料

1．蒸餾水。

2．加樣器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。

3．振蕩器及磁力攪拌器等。

安全性

1．避免直接接觸終止液和底物A、B。一旦接觸到這些液體，請儘快用水沖洗。

2．實驗中不要吃喝、抽煙或使用化妝品。

3．不要用嘴吸取試劑盒裡的任何成份。

4．試劑應按標籤說明書儲存，使用前恢復到室溫。稀稀過後的標準品應丟棄，不可保存。

5．實驗中不用的板條應立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質。

6．不用的其它試劑應包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質前使用。

7．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

8．使用乾淨的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒裡的各種成份及樣品。

9．洗滌酶標板時應充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標反應孔中吸水。

10．底物A應揮發，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露於光下。避免用手接觸，有毒。實驗完成後應立即讀取OD值。

11．加入試劑的順序應一致，以保證所有反應板孔溫育的時間一樣。

12．按照說明書中標明的時間、加液的量及順序進行溫育操作。

做好對照

正式試驗時，應分別以陽性對照與陰性對照控制試驗條件，待檢樣品應作一式二份，以保證實驗結果的準確性。有時本底較高，說明有非特異性反應，可採用羊血清、兔血清或BSA等封閉。

實驗條件的選擇

在ELISA中，進行各項實驗條件的選擇是很重要的，其中包括:

（1）固相載體的選擇：許多物質可作為固相載體，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙醯胺和纖維素等。其形式可以是凹孔平板、試管、珠粒等。目前常用的是40孔聚苯乙烯凹孔板。不管何種載體，在使用前均可進行篩選：用等量抗原包被，在同一實驗條件下進行反應，觀察其顯色反應是否均一性，據此判明其吸附性能是否良好。

（2）包被抗體（或抗原）的選擇：將抗體（或抗原）吸附在固相載體表面時，要求純度要好，吸附時一般要求PH在9.0～9.6之間。吸附溫度，時間及其蛋白量也有一定影響，一般多採用4℃ 18～24小時。蛋白質包被的最適濃度需進行滴定：即用不同的蛋白質濃度（0.1、1.0和10μg/ml等）進行包被后，在其它試驗條件相同時，觀察陽性標本的OD值。選擇OD值最大而蛋白量最少的濃度。對於多數蛋白質來說通常為1～10μg/ml。

（3）酶標記抗體工作濃度的選擇：首先用直接ELISA法進行初步效價的滴定（見酶標記抗體部份）。然後再固定其它條件或採取“方陣法”（包被物、待檢樣品的參考品及酶標記抗體分別為不同的稀釋度）在正式實驗系統里準確地滴定其工作濃度。

（4）酶的底物及供氫體的選擇：對供氫體的選擇要求是價廉、安全、有明顯地顯色反應，而本身無色。有些供氫體（如OPD等）有潛在的致癌作用，應注意防護。有條件者應使用不致癌、靈敏度高的供氫體，如TMB和ABTS是目前較為滿意的供氫體。底物作用一段時間后，應加入強酸或強鹼以終止反應。通常底物作用時間，以10-30分鐘為宜。底物使用液必須新鮮配製，尤其是H2O2在臨用前加入。

進口分裝：

檢測範圍和靈敏度不同，用量少時，可使用分裝，前期是它的長久性不是很好。

試劑盒的標準曲線最高點OD值均在2.0±0.2，零孔的OD值都控制在0.10以下。

試劑盒的標準曲線相關係數R≥0.98。

試劑盒重複性好，板內、板間變異係數均<9%。

試劑的組份都多給20%的富餘量，確保完成48/96孔的檢測，避免分次檢測可能造成試劑量不足的情況。

檢測抗體及酶結合物的稀釋度合適(均為1:30)，方便試驗操作者準確地做稀釋工作，保證實驗結果的重複性。

白介素6是一種細胞因子，已被證實為B細胞分化因子。它是一種抗體形成系統，它的生理特性，如肝細胞急性蛋白合成的誘導和基於和白介素3協同作用的生長刺激等，也備受關注，並且已證實白介素-6與病理學存在穩定的相關關係。例如，報道多種疾病的生長因子為白介素-6，骨髓瘤細胞能合成白介素-6並表達白介素-6受體。此外，白介素6在多種炎性疾病和自身免疫疾病發揮重要的作用。此試劑盒能高靈敏度的檢測小鼠血清和細胞基質上清的白介素6原理此試劑盒運用了兩種特異性抗體，洗板后加入TMB底物液顯色，顯色的強度與小鼠的白介素-6的量成正比. 檢測範圍10.94的700pg/mL預期用途

ELISA法是免疫診斷中的一項新技術，現已成功地應用於多種病原微生物所引起的傳染病、寄生蟲病及非傳染病等方面的免疫診斷。也已應用於大分子抗原和小分子抗原的定量測定，根據已經使用的結果，認為ELISA法具有靈敏、特異、簡單、快速、穩定及易於自動化操作等特點。不僅適用於臨床標本的檢查，而且由於一天之內可以檢查幾百甚至上千份標本，因此，也適合於血清流行病學調查。本法不僅可以用來測定抗體，而且也可用於測定體液中的循環抗原，所以也是一種早期診斷的良好方法。因此ELISA法在生物醫學各領域的應用範圍日益擴大，

可概括四個方面：

1、免疫酶染色各種細胞內成份的定位。

2、研究抗酶抗體的合成。

3、顯現微量的免疫沉澱反應。

4、定量檢測體液中抗原或抗體成份。

ELISA試劑盒檢測過程中的注意事項