亞細胞定位

亞細胞定位

亞細胞定位是指某種蛋白或表達產物在細胞內的具體存在部位。例如在核內、胞質內或者細胞膜上存在。GFP綠色熒光蛋白,在掃描共聚焦顯微鏡的激光照射下會發出綠色熒光,從而可以精確地定位蛋白質的位置。

定義


GFP,實際是給你要研究的物質加上標記,在此相當於報告蛋白的作用。使用GFP必須構建融合蛋白載體,並在轉染之後有效表達。這樣,若在熒光顯微鏡下看到細胞內某一部位存在GFP信號,說明和GFP融合的蛋白也存在於該部位,這樣就達到了確定某物質亞細胞定位的目的。

應用實例


基因槍法轉化洋蔥表皮細胞:
分別用70%乙醇和滅菌蒸餾水清洗金粉(直徑為1 μm),加入滅菌蒸餾水製成金粉懸浮液,取100 μL 放在含有1.0 cm2 洋蔥表皮的玻璃皿中,邊振蕩邊加入10 μL pCambia2301-GaMYB2-GFP質粒,逐步加入40 μL 0.1 mol·L-1 亞精胺和100 μL2.5 mol·L-1 CaCl2,振蕩混勻。基因槍GDS-80轟擊時氦氣罐的氣壓為1 300 psi,取10 μL DNA 包裹好的微粒懸浮液加到基因槍中央,進行轟擊,之後放置25℃避光過夜培養,使用ConfocalLaser激光共聚焦顯微鏡觀察。
亞細胞定位
亞細胞定位
亞細胞定位
亞細胞定位
GaMYB2 在洋蔥表皮細胞中的瞬時表達分析:採用基因槍轟擊的方法,用包裹質粒的金粉對洋蔥表皮進行轟擊,暗培養過夜后,在激光共聚焦顯微鏡下進行觀察,從圖A 中可以看出對照GFP空載體在整個洋蔥細胞均能看到綠色熒光,為組成型表達;從圖B 中發現GaMYB2-GFP 的融合表達載體只能在細胞核中能看到綠色熒光,這進一步證明該蛋白不具有跨膜蛋白結構,定位在細胞核中,具有轉錄因子的一般特徵。

生物信息學預測法


不同的細胞器往往具有不同的理化環境,它根據蛋白質的結構及表面理化特徵,選擇性容納蛋白。
蛋白質表面直接暴露於細胞器環境中,它由序列摺疊過程決定,而後者取決於氨基酸組成。因此可以通過氨基酸組成進行亞細胞定位的生物信息學預測。

免疫熒光法


將標記的特異性熒光抗體,直接加在抗原標本上,經一定的溫度和時間的染色,用水洗去未參加反應的多餘熒光抗體,室溫下乾燥后封片、鏡檢
間接法
如檢查未知抗原,先用已知未標記的特異抗體(第一抗體)與抗原標本進行反應,用水洗去未反應的抗體,再用標記的抗抗體(第二抗體)與抗原標本反應,使之形成抗體—抗原—抗體複合物,再用水洗去未反應的標記抗體乾燥、封片後鏡檢。如果檢查未知抗體,則表明抗原標本是已知的,待檢血清為第一抗體,其它步驟的抗原檢查相同。