植物體細胞雜交
植物體細胞雜交
植物體細胞雜交（plant somatic hybridization）,又稱原生質體融合（Protoplast fusion ）是指將植物不同種、屬，甚至科間的原生質體通過人工方法誘導融合，然後進行離體培養，使其再生雜種植株的技術。植物細胞具有細胞壁，未脫徠壁的兩個細胞是很難融合的，植物細胞只有在脫去細胞壁成為原生質體后才能融合，所以植物的細胞融合也稱為原生質體融合。
重要進展
1960年，Cocking用酶法製備高等植物原生質體首次獲得成功；
1970年，Power首次用硝酸鈉進行為誘導劑進行了較大規模的原生質體誘導融合；
1971年，Nagata和Takebe首次從離體煙草原生質體培養中獲得再生完整植株；
1972年，Carlson首次獲得粉藍煙草和郎氏煙草的細胞雜種，這也是第一個植物細胞雜種；
1974年，Kao將聚乙二醇誘導融合法應用於植物細胞融合併建立了相應的融合技術；
1978年，Melchers獲得了第一個屬間細胞雜種（番茄+馬鈴薯）；
1981年，Zimmerman發明了電融合儀，並首次提出了電融合概念；
1987年，Schweiger建立了單對原生質體電融合技術程序！
1991年，R.Wiegand和R.W.Steubing等利用光鑷將大鼠的B-淋巴細胞與骨髓瘤細胞對接，形成預雜種，再利用UV激光微束照射，使膜消失並完全融合，形成雜交細胞。
根據融合時細胞的完整程度，原生質體融合可分為兩大類：
對稱融合（symmetric fusion）－即兩個完整的細胞原生質體融合。
非對稱融合（asymmetric fusion）－利用物理或化學方法使某親本的核或細胞質失活后再進行融合，它可以分為幾種：
用於細胞核或細胞質失活的方法分為物理和化學兩大類：
物理方法常採用射線處理，如X射線、射線等，它們能使細胞核失活；還有離心，振動，電激等。
化學處理目前常用的試劑有聚乙二醇（PEG）誘導融合，核失活－碘乙醯胺（IOA）、碘乙酸(Iodoacetate)；質失活－羅丹明（R－6－G，它是一種親脂染料，能夠抑制線粒體的氧化磷酸化過程而達到失活作用。
將植物細胞A與植物細胞B用纖維素酶和果膠酶處理，得到不含細胞壁的原生質體A和原生質體B，運用物理方法或是化學方法誘導融合，形成雜種細胞，再利用植物細胞培養技術將雜種細胞培養成雜種植物體。
①雜交時間：植物細胞雜交是從細胞融合開始，到培育成的新植物體結束。
a.原生質體製備：用酶解法去除細胞壁（纖維素酶和果膠酶）
b.原生質體融合：膜融合（高鈣、高pH誘導融合）、核融合（雜種細胞第一次有絲分裂時融合）
原生質體的融合
1．PEG誘導融合法
PEG誘導融合的特點：其優點是融合成本低，勿需特殊設備；融合子產生的異核率較高；融合過程不受物種限制。其缺點是融合過程繁瑣，PEG可能對細胞有毒害。
PEG的作用機理： Kao等認為，由於PEG分子具有輕微的負極性，故可以與具有正極性基團的水、蛋白質和碳水化合物等形成H鍵，從而在原生質體之間形成分子橋，其結果是使原生質體發生粘連進而促使原生質體的融合；另外，PEG能增加類脂膜的流動性，也使原生質體的核、細胞器發生融合成為可能。
融合技術要點：
融合液：CaCl2·2H2O 8~10mmol
KH2PO4 0.7mmol
甘露醇或山梨醇 0.5~1.0mol
pH 5.6
誘導液：融合液+PEG 20～45%
稀釋液：A液（g/100ml）pH6.0 B液（g/100ml）pH10.5
葡萄糖7.21甘氨酸0.375
CaCl2·2H2O 0.79 NaOH 0.169
DMSO 10ml
2．電融合法
與PEG融合比較起來，電融合有三大優點：一是不存在對細胞的毒害問題；二是融合效率高；三是融合技術操作簡便。
電融合儀的結構特點：一是交變電場部分；一是高頻直流電擊部分。
電融合的基本過程：
細胞膜的接觸：當原生質體置於電導率很低的溶液中時，電場通電后，電流即通過原生質體而不是通過溶液，其結果是原生質體在電場作用下極化而產生偶極子，從而使原生質體緊密接觸排列成串；
P1 P2
P1 P2
混合靜止1min.
融 合
融合液
加入PEG
稀 釋洗 滌
加入稀釋液
加入培養基
培 養
選 擇
華中農業大學創建國家精品課程——細胞工程學 文本教案(第七章) 主講教師：柳俊博士、教授膜的擊穿：原生質體成串排列后，立即給予高頻直流脈衝就可以使原生質膜擊穿，從而導致兩個緊密接觸的細胞融合在一起。
關於融合參數：電融合中的主要參數包括交流電壓、交變電場的振幅頻率、交變電場的處理時間；直流高頻電壓、脈衝寬度、脈衝次數等。
首先，原生質體質量對細胞的融合起著至關重要的作用，高質量的原生質體是細胞融合的首要條件。
其次，融合方法
其三是融合參數，包括各種融合液都應選擇適當。
c.方法：物理方法（離心、振動、電激）、化學方法（聚乙二醇（PEG））
徠d.雜種細胞的篩選和培養：機械法、生理法、遺傳法
e.雜種細胞的再生和鑒定：由愈傷組織再培養出雜種植株的過程
雜種細胞的發育動態及體細胞雜種鑒定
一、雜種細胞的發育動態
核質重組
細胞器重組
部分核物質或細胞器丟失
核分裂的非同步性
二、體細胞雜種的特點
形態上的趨中性
變異幅度大
非整倍性
雙親性狀的共顯性
偏親現象
三、雜種細胞的選擇系統與雜種植株的鑒定
1．雜種細胞的選擇系統
外觀選擇
互補選擇
熒游標記選擇
2．體細胞雜種的鑒定
形態鑒定：根據雙親的形態學性狀觀察進行鑒定。
細胞學鑒定：細胞器鑒定、染色體鑒定。
生化鑒定：同功酶鑒定。
分子鑒定：RFLP鑒定、RAPD標記鑒定。
體細胞雜種的遺傳特性
1．細胞分裂與染色體丟失
如果細胞分裂而核不發生融合，在以後的發育過程中就會有兩種結果，一是細胞分裂幾次以後即停止生長從而導致死亡；二是在發育過程中某一親本的細胞核部分或全部丟失。如果這樣就會產生幾種情況：A細胞+B細胞質；A細胞+B細胞質和部分染色體或基因。
2．基因轉移與性狀表達由於染色體的部分丟失，常常使某個親本的部分或個別基因與另一親本的染色體發生整合，其結果是實現了親本間的基因轉移。基因轉移通常是在後代中某些性狀得以表達，有時由於基因的重組也可能產生雙親均沒有的新性狀。
3．體細胞雜種遺傳上的不穩定性體細胞雜種後代在遺傳上常常不穩定，這可能涉及到多方面的因素，如親緣關係的遠近、培養過程中的染色體變異、細胞核、細胞質遺傳物質的重組等。
②優點：克服遠緣雜交不親和的障礙，擴大雜交親本範圍，培育新優良品種。
③舉例：“白菜-甘藍”同白菜相比，具有生長期短，耐熱性強，和易儲藏等優點。
體細胞雜種的應用
一、體細胞雜種的應用潛力
1、植物育種中的核質替換
2、細胞質雜種的獲得
3、遠緣雜交創造新物種
4、細胞器的互作研究
1、融合特性的高效性
2、雜種細胞的培養和選擇
3、雜種的遺傳穩定性控制
1、誘導融合及雜種細胞的各種生理、生化、遺傳機理的研 究
2、電融合的程序化控制研究
3、各種類型原生質體（胞質體、核質體、細胞器）的製備技術研究
4、雜種細胞培養技術的程序化研究
